A junção neuromuscular (JNM) é alterada em uma variedade de condições que às vezes podem culminar em insuficiência sináptica. Este relatório descreve métodos baseados em microscópio de fluorescência para quantificar essas mudanças estruturais.
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Artigo de método
A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal
Neste artigo
Resumo
Resumo
A junção neuromuscular (JNM) é o grande, sinapse relé colinérgicos através do qual os neurônios motores mamíferos controlar a contração muscular voluntária. As mudanças estruturais na JNM pode resultar em falha da neurotransmissão, resultando em fraqueza, atrofia e até mesmo a morte da fibra muscular. Muitos estudos têm investigado como modificações genéticas ou doença pode alterar a estrutura do JNM rato. Infelizmente, pode ser difícil comparar os resultados directamente a partir destes estudos, uma vez que eles frequentemente utilizados diferentes parâmetros e métodos analíticos. Três protocolos estão descritos aqui. O primeiro utiliza projecção de intensidade máxima imagens confocais para medir a área de receptor de acetilcolina (AChR) da membrana pós-sinápticos domínios ricos em na placa terminal e a área de coloração das vesículas sinápticas no terminal do nervo pré-sináptico sobrejacente. O segundo protocolo compara as intensidades relativas de imunocoloração para proteínas sinápticas na membrana pós-sináptica. O terceiro protocol usa Transferência de Fluorescência de Ressonância Energia (FRET) para detectar alterações na embalagem de AChRs pós-sinápticos na placa motora. Os protocolos foram desenvolvidos e aperfeiçoados ao longo de uma série de estudos. Fatores que influenciam a qualidade e consistência dos resultados são discutidos e dados normativos são fornecidos para NMJs em ratos adultos jovens e saudáveis.
Introdução
A junção neuromuscular (JNM) é a sinapse relé crítico que medeia a comunicação entre o sistema nervoso e no músculo esquelético. Ela é necessária para todo o movimento voluntário. A microscopia de fluorescência tem sido utilizada para estudar os efeitos de transgenes no rato JNM 1-3 ou para comparar os efeitos da idade, dieta, exercício e doença agravada por NMJs roedor 4-11. Tais estudos têm nos ensinado muito sobre a fisiologia e fisiopatologia da JNM, mas os diversos parâmetros relatados (por exemplo, a área AChR, área de placa motora, comprimento perímetro, os índices de fragmentação), muitas vezes tornam difícil comparar os resulta....
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Protocolo
NOTA: concepção, realização e divulgação de experiências com animais devem ter em conta as diretrizes atuais 24. Esse trabalho deve ser previamente aprovado pela autoridade de bem-estar animal local (no nosso caso, o Comité de Ética Animal da Universidade de Sydney).
1. A eutanásia do animal e Dissection Muscle
- Transferir o rato da sala de exploração para uma sala separada onde é sacrificado com uma injeção intraperitoneal de solução de pentobarbital (30 mg / kg), utilizando o método de manuseio do mouse detalhado por Shimizu 25. Posicione o mouse de volta para sua gaiola.
- Uma vez que a respiração do rato parou por m....
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Resultados
Medição do Synaptic Area no NMJ
Qualquer estimativa de área depende do desenho de um limite para definir a extensão de especializações sinápticas. Em músculos adultos jovens saudáveis imagens JNM deve exibir limites bem definidos para ambos AChR e coloração sinaptofisina (Figura 2A e B). A intensidade da fluorescência para ambos AChR e sinaptofisina aumenta acentuadamente no limite entre a parte de peri-sináptica e sináptica da placa motor.......
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Discussão
Os protocolos descritos aqui nos permitiram medir de forma confiável e quantificar mudanças nas propriedades do NMJ através de uma série de condições, incluindo estados normais de envelhecimento e doenças. Os métodos descritos para en enfrentar imagens JNM vai permitir aos pesquisadores comparar a área de especializações pré e pós-sinápticos e da área de sináptica sobreposição / alinhamento. Para comparar a intensidade relativa de proteínas pré e pós-sinápticos O segundo protocolo, que usa cortes ópticos transversais, é.......
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Divulgações
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo National Health and Medical Research Council [570930]. A imagem foi realizada no Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Ex-membros do laboratório, cujo trabalho é citado, são agradecidos por suas contribuições para o desenvolvimento desses métodos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscópio confocal de varredura | Leica | DM 2000 com Sistema TCS SP2 | A maioria dos microscópios confocais de varredura deve ser adequada. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxina (vermelho-BGT) | Life technologies | B35451 | Usado para rotular AChRs |
| Alexa647-&alfa;-bungarotoxina (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Fluorescência vermelha distante: quase invisível através da ocular |
| anti-sinaptofisina de coelho | Life technologies | 18-0130 | Diferentes lotes de anticorpos primários diferem na diluição de trabalho |
| eficaz FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Anticorpo monoclonal conjugado a FITC |
| FITC-burro anti-coelho IgG | Jackson | 711-095-152 | Os anticorpos secundários policlonais podem variar em qualidade de acordo com a fonte e o lote |
| Composto de temperatura de corte ideal (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Matriz de incorporação de criostato para congelamento de músculos |
| DABCO | Sigma | 10981 | Meio de montagem que retarda o fotobranqueamento de fluoróforos |
Referências
- Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
- Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding ....
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Reimpressões e permissões
