Metod för bedömning av effekterna av ett intervall av våglängder och intensiteter från Red / nära infraröda Ljusterapi på oxidativ stress<em> In Vitro</em
Summary
Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.
Abstract
Röd / nära infraröda ljusterapi (R / NIR-LT), som levereras med laser eller lysdiod (LED), förbättrar funktionella och morfologiska resultat i en rad centrala nervsystemet skador in vivo, möjligen genom att minska oxidativ stress. Dock har effekterna av R / NIR-LT på oxidativ stress visats variera beroende på våglängd eller Bestrålningsstyrkan. Studier som jämför behandlingsparametrar saknas på grund av avsaknaden av kommersiellt tillgängliga anordningar som levererar flera våglängder eller intensiteter, som är lämpliga för hög genom-sätta in vitro optimeringsstudier. Detta protokoll beskriver en teknik för tillförsel av ljus vid ett intervall av våglängder och intensiteter för att optimera terapeutiska doser som krävs för en given skada modell. Vi antog att en metod för att leverera ljus, där våglängd och intensitet parametrar lätt kunde ändras, skulle kunna underlätta bestämningen av en optimal dos av R / NIR-LT för att minska reaktiva syreradikaler(ROS) in vitro.
Icke-koherent Xenon ljus filtrerades genom smalbandsinterferensfilter för att leverera olika våglängder (mittvåglängderna 440, 550, 670 och 810nm) och fluenser (8,5 x 10 -3 till 3,8 x 10 -1 J / cm 2) av ljus till odlade celler. Ljusflöde från apparaten kalibrerades att avge terapeutiskt relevanta, lika quantal doser av ljus vid varje våglängd. Reaktiva arter detekterades i glutamat stressade celler behandlade med ljuset, med användning av DCFH-DA och H 2 O 2 känsliga fluorescerande färgämnen.
Vi levererade framgångsrikt ljus vid en rad fysiologiskt och terapeutiskt relevanta våglängder och intensiteter, till odlade celler som utsätts för glutamat som en modell för CNS skada. Medan fluenser för R / NIR-LT används i den aktuella studien inte utövar en effekt på ROS genereras av de odlade cellerna, är metoden för ljus leverans tillämpas på andra systems inklusive isolerade mitokondrier eller flera fysiologiskt relevanta organotypiska slice kultur modeller, och kan användas för att bedöma effekterna på en rad utfallsmått av oxidativ metabolism.
Introduction
Reaktiva syreradikaler (ROS) krävs för en rad signaltransduktionsvägar och normala reaktioner av cellulär metabolism, däribland neuroprotektion 1. Men när endogena antioxidant mekanism inte kan kontrollera produktionen av ROS, kan celler falla för oxidativ stress 2,3. Efter skada på CNS, är de associerade ökar i närvaro av ROS och oxidativ stress tros spela en viktig roll i utvecklingen av skador 4,5. Trots den omfattande antal strategier för att dämpa oxidativ stress som har bedömts, finns det för närvarande inga helt effektiva, kliniskt relevanta antioxidant strategier för att dämpa ROS produktion och tillhörande oxidativ stress i klinisk användning efter neurotrauma 6. Dämpningen av oxidativ stress förblir därför ett viktigt mål för terapeutisk intervention 7.
Förbättringar följering R / NIR-LT har rapporterats i ett brett spektrum av skador och sjukdomar, inklusive minskningar av kardiell infarktstorlek, njur- och lever komplikationer under diabetes, retinal degeneration, CNS skada och stroke 8, kanske genom att minska oxidativ stress. Särskilt när det gäller CNS skada, har prekliniska studier av effekten av 670nm ljus visat goda effekter i modeller för retinal degeneration 9-11, ryggmärgsskada 12, neuronal död 13. Kliniska studier har utförts för torr åldersrelaterad makuladegeneration och pågår för närvarande för stroke 14, men resultaten av dessa studier inte verkar lovande, kanske på grund av underlåtenhet att anställa effektiv behandling Parametrar 15. Som sådan, R / NIR-LT har inte fått stor spridning som en del av normal klinisk praxis i neurotrauma, trots att en enkel att administrera, icke-invasiv och relativt billig behandling. Hinder för klinisk översättning inkluderar brist på en cltidigt förstod verkningsmekanism och frånvaro av ett standardiserat effektiv behandlingsprotokoll 16,17. Aktuell litteratur rörande ljusterapi avslöjar en uppsjö av variation i behandlingsparametrar avseende bestrålningstider källor (LED eller laser), våglängd (t.ex. 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), total dos (joule bestrålning / ytenhet), längd (exponeringstid), timing (före eller efter förolämpning), behandlingsfrekvens och leveranssätt (puls eller kontinuerlig) 8. Variationen i behandlingsparametrar mellan studier gör jämförelsen svår och har bidragit till skepsis effekt 16.
Därför är tydligt krävs optimering av R / NIR-LT, med cellodlingssystem kan ge kontrollmekanismen nödvändigt att jämföra flera variabler hög genomströmning. Men det finns få kommersiellt tillgängliga belysningssystem som kan ge tillräcklig flexibilitet och kontroll över wavelength och intensitet för att utföra sådana optimeringsexperiment. Kommersiellt tillgängliga LED-enheter är i allmänhet inte kan leverera flera våglängder eller intensiteter, vilket resulterar i utredarna använder flera LED enheter från olika tillverkare, som kan variera inte bara i intensitet, men också det spektrum av våglängd av ljus som avges. Vi har tagit upp denna fråga genom att använda en bredbands Xenon ljuskälla filtreras genom smalbandiga interferensfilter och därigenom generera en rad våglängder och fluenser av ljus, vilket gör att nära, noggrann kontroll av parametrarna R / NIR-LT.
Det är viktigt att notera att den terapeutiska dosen av behandling definieras av antalet fotoner växelverkar med photoacceptor (kromofor), vilken, i fallet med R / NIR-LT postuleras vara cytokrom c oxidas (COX) 18. Photon levererad energi varierar med våglängden; vilket innebär lika stora doser av energi vid olika våglängder blir comuppskattad av olika antal fotoner. Därför var det ljus som emitteras från anordningen kalibreras för att avge ett lika stort antal fotoner för var och en av de valda våglängderna som skall testas. Vi har utvecklat ett system som kan användas för att leverera R / NIR-LT vid ett våglängdsområde och intensiteter till celler in vitro och visat förmåga att mäta effekterna av den levererade R / NIR-LT på ROS produktion i celler som utsätts för glutamat stress.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har framgångsrikt anpassat en exakt och kalibrerat ljusleveranssystem för att tillhandahålla en mekanism för studie av optimering av R / NIR-LT in vitro. Våglängd och intensitet parametrar R / NIR-LT kan manipuleras korrekt och effektivt med hjälp av detta system. Vi etablerade att ljusbehandling av cellerna ledde inte till celldöd, även om ROS inte reducerades vid våglängder och doser levererats, i celltyper testade. De maximala stödnivåer som uppnåtts genom det nuvarande systemet vid 670nm (2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.
Materials
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | – | |
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | – | |
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | – | |
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | – | |
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | – | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | – | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 75cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20°C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20°C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | – | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | – | |
| Centrifuge | Standard lab epuipment | – | |
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | – | |
| 442nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
Referências
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neurociência. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
