Ontwikkeling van een<em> In vitro</em> Modelsysteem voor het bestuderen van de interactie van<em> Equus</em><em> Caballus</em> IgE met zijn receptor met hoge affiniteit FceRI
Summary
The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.
Abstract
The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.
Introduction
Allergie is gekend voor duizenden jaren. Een astma-behandeling werd beschreven in het Oude Egyptische medische tekst die bekend staat als de Ebers Papyrus (~ 1550 BCE) en besproken kruidenmiddelen om het 7 behandelen.
Vandaag allergie geclassificeerd als type I overgevoeligheidsreactie, waarbij de T-helpercel type 2 (Th2) arm van het immuunsysteem stuurt de productie van immunoglobuline E (IgE) antilichamen in respons op omgevingsveranderingen antigenen genoemd allergenen. Dit zijn verschillende stoffen die gewoonlijk interactie met cellen in het immuunsysteem en stimuleert de synthese en secretie van pro-inflammatoire cytokines, zoals interleukine-4 en interleukine-13 8, 9 als er deeltjes in sigarettenrook of dieseldeeltjes IgE synthese verbeteren 10.
De stijging van allergische manifestaties industrielanden de afgelopen 50 jaar is toegeschreven aan een combinatie van het effect vanmilieuverontreinigende stoffen en een trend naar een meer hygiënische omgeving, die samen de immuunrespons tegen een profiel overheerst TH 2 cytokines verschuiven, zoals de "Hygiene Hypothesis '11 voorgesteld.
Zoals hierboven vermeld, mensen niet de enige zoogdieren getroffen door allergie. Met name paarden en honden kunnen ook klassieke allergische reacties ontwikkelen en een studie met 12 blijkt dat, bij mensen, paarden allergie wordt toegeschreven aan genetische en omgevingsfactoren. Bijgevolg dienen deze dieren goed model voor het bestuderen van de interactie tussen genetische en oorzaken van allergie, de progressie van sensibilisatie voor ziekte, en mogelijke interventiestrategieën nadat klinische verschijnselen worden in
In 1887, Stömmer was de eerste persoon die de gelijkenis tussen mensen en paarden astma 13 beschrijven, het effect van histamine op de paarden cardiovasculaire systeem isvergelijkbaar met die van mensen 14. Paarden zijn ook de hoeksteen van de paardenrennen, dat is een waarde van US $ 72000000000 met een betting omzet van US $ 115.000.000.000 per jaar 15.
De meeste hedendaagse renpaarden zijn afstammelingen van het kleine aantal Arabische paarden gefokt door Lady Anne Blunt van 1878 en later. Moderne renpaarden worden vaak inteelt te selecteren voor de prestaties vaardigheden. Ze zijn gevoelig voor genetische aandoeningen, waarvan hun gevoeligheid voor allergische reacties monteren. Ze hebben ook 1000 maal hoger serum IgE-gehaltes dan zelfs de meest zwaar allergische mensen 16. Paard allergische reacties zijn meestal manifesteert als insectenbeet overgevoeligheid (IBH) 17, 18. IBH resultaten in dermatitis als gevolg van beten vormen insecten in het geslacht Culicoides. Een andere vorm van paardachtigen allergische ziekte terugkerende luchtweg obstructies (RAO) Dit manifesteert zich in de longen en luchtwegen. Het wordt gekenmerkt door een piepende ademhaling en labORed ademhaling. RAO zich vaker voordoet in reactie op sporen vormen en hoge allergeen-specifieke IgE niveaus zijn opgenomen in paarden met RAO in een studie 19 hoewel andere onderzoek niet heeft bevestigd 20.
Studies over paarden allergie stond de poging tot controle en neutraliseren paarden IgE door de ontwikkeling van anti-paarden IgE monoklonale antilichamen (mAbs) 21 22. Verder is de studie van 23 beschrijft de productie van de extracellulaire domeinen van α paarden hoge affiniteit Fc receptor chain (FceRIa) receptor in een poging het detecteren en kwantificeren equine serum IgE. Een verwante studie van Ledin 24 bespreekt een nieuwe aanpak gericht op het neutraliseren van serum IgE door priming het immuunsysteem met behulp van een zelf / niet-zelf immunogeen. Al deze studies echter miste een effectieve test om de veiligheid en werkzaamheid van de testprotocollen. In dit artikel hebben we nu zo'n assay sys presenterenteem voor het bestuderen van diagnostische en therapeutische strategieën om de paarden systeem, waarbij β-hexosaminidase afgifte, als een indicator van cel mediator degranulatie werd beoordeeld op RBL-cellen die 2H3.1 paarden FceRIa relevant. Dit protocol is gebaseerd op eerdere publicaties 25, 4, 5, 2, 3 beschrijft de constructie van RBL-cellen getransfecteerd met het gen dat codeert voor het IgE bindende domein van de receptor met hoge affiniteit voor IgE van verschillende species. Het protocol wordt uitgelegd hoe een β-hexosaminidase afgifte assay uitgevoerd, waarvan de resultaten worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaardafwijking van drievoudige experimenten.
De release assay werd voor het eerst ontwikkeld door Siraganian en Haak 25 tot mens allergie te bestuderen. Het lab groep onder leiding van Dr. Reuben Siraganian ontwikkelde ook het RBL cellijn. Deze RBL cellen werden ontwikkeld om de menselijke FcsRIa uiten en het protocol dat werd gepubliceerd door 4. Het laatste stukjevan de test kwam met de ontwikkeling van het plasmide pSV in het artikel van Neuberger 26 die de productie van IgE-antilichamen beschreven door kloneren zijn zware keten gen stroomafwaarts van een muis gen voor een variabel gebied IgE dat het hapteen 4-hydroxy-3 richt nitro-phenacetyl (NP), het resulterende chimere antilichaam volledig functioneel. De mogelijkheid om een IgE ontwikkelen zij hetzelfde hapteen, maar ook klonen zijn receptor op het oppervlak van RBL-cellen resulteerde in de standaardisatie van de test waardoor het een bruikbaar protocol voor de degranulatie van basofiele cellen te meten.
De test heeft wel voor- en nadelen. De voordelen van de test is de aanpasbaarheid te gebruiken in zoogdiercelsystemen, ons lab is dus gebruikt om te testen op de degranulatie van de mens, honden en paarden systemen, en dit kan worden bereikt door eenvoudig synthetiseren IgE het organisme en klonen zijn receptor op het oppervlak van de RBL-cellen.
Anderzijds,de nadelen van de test is dat de RBL-cellen zeer gevoelig zijn voor thermische, mechanische en PH veranderingen, waardoor ze een variatie van degranulatie niveaus in dezelfde test. Het wordt dus sterk aangeraden dat de assays altijd worden herhaald in drievoud en vervolgens een gemiddelde wordt genomen van hen. Bovendien is de RBL cellen neigen te verschuiven naar een niet lossend fenotype als ze nog in weefselkweek langere tijden (> 10 weken) 27, waardoor het onderhoud omslachtig. Zij zijn ook gevoelig voor infecties door mycoplasma bacteriën, die onzichtbaar zijn van een lichtmicroscoop en kan de morfologie van de cel niet gewijzigd, maar zouden hun degranulatie niveaus drastisch veranderen. Dus regelmatig mycoplasma tests nodig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Samengevat zijn de resultaten van dit onderzoek bleek dat wanneer RBL-2H3.1 cellen die paarden FcsRIa worden gesensibiliseerd met paarden IgE en uitgedaagd door een antigeen, ze geven een piek mediator release van 36,68% ± 4,88% van het totale bedrag van de mediator in de cellen, vergeleken met de RBL-2H3.1 oorspronkelijke cellen niet tot expressie paarden FcsRIa.
Dus deze test biedt een nuttig instrument voor het onderzoeken en bestuderen van equine allergische reacties in vitro. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Lynda Partridge for the provision of advice and laboratory facilities.
Materials
| RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα | – | – | Produced in the lab |
| Equine IgE anti NIP-HSA | – | – | Produced in the lab |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | – |
| Multi Channel Pipette | Anachem | – | – |
| Incubator | Galaxy R | – | – |
| 4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab |
| Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin | Sigma | A6661 | Abbreviated DNP-HSA |
| Plate Spectrophotometer | Anthos Labtec HT2 | – | – |
| Pipes | Sigma | P1851 | – |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | – |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | – |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | – |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | – |
| Triton x100 | Sigma | X100 | – |
| 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | N9376 | Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | – |
| Citric Acid | Sigma | 251275 | – |
| Sodium Acetate | Sigma | S7670 | – |
| Tris | Sigma | T5941 | – |
Referências
- Taudou, G., et al. Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE. Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).
- Sabban, S. . Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity FcεRI Receptor. , (2011).
- Sabban, S., Ye, H., Helm, B. A. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity Receptor FcεRI. Vet ImmunolImmunopathol. 153 (1-2), 6-10 (2013).
- Wilson, A. P. M., Pullar, C. E., Camp, A. M., Helm, B. A. Human IgE mediates stimulus secretion coupling in rat basophilic leukemia cells transfected with the a chain of the human high-affinity receptor. Eur J Immunol. 23, 240-244 (1993).
- Hunter, M. J., Vratimos, A. P., Housden, J. E. M., Helm, B. A. Generation of canine-human Fc IgE chimeric antibodies for the determination of the canine IgE domain of interaction with FcεRIα. MolImmunol. 45 (8), 2262-2268 (2008).
- Rashid, A., et al. Review: Diagnostic and therapeutic applications of rat basophilic leukemia cells. MolImmunol. 52 (3-4), 224-228 (2012).
- Cohen, S. G. Asthma in antiquity: the Ebers Papyrus. Allergy Proc. 13 (3), 147-154 (1992).
- Dudler, T., et al. A link between catalytic activity, IgE-independent mast cell activation, and allergenicity of bee venom phospholipase A2. J. Immunol. 155, 2605-2613 (1995).
- Machado, D. C., Horton, D., Harrop, R., Peachell, P. T., Helm, B. A. Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen-specific IgE. Eur J Immunol. 26 (12), 2972-2980 (1996).
- Smyth, L. J., et al. Assessment of the molecular basis of pro-allergenic effects of cigarette smoke. Environ Sci Technol. 34 (7), 1370-1374 (2000).
- Okada, H., Kuhn, C., Feillet, H., Bach, J. F. The ‘hygiene hypothesis’ for autoimmune and allergic diseases: an update. ClinExpImmunol. 160 (1), 1-9 (2010).
- Eder, C., et al. Influence of environmental and genetic factors on allergen-specific immunoglobulin-E levels in sera from Lipizzan horses. Equine Vet J. 33 (7), 714-720 (2001).
- Cook, W. R., Rossdale, P. D. The syndrome of ‘Broken Wind’ in the horse. Proceedings of the Royal Society of Medicine. 56, 972-977 (1963).
- Eyre, P., Lewis, A. J. Acute systemic anaphylaxis in the horse. Br. J. Pharmacol. 48 (3), 426-437 (1973).
- Wagner, B. IgE in horses: occurrence in health and disease. Vet ImmunolImmunopathol. 132 (1), 21-23 (2009).
- Hellberg, W., et al. Equine insect bite hypersensitivity: immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoidesnubeculosus salivary gland extract. Vet. Immunol. Immunopathol. 113 (1-2), 99-112 (2006).
- Schaffartzik, A., et al. Equine insect bite hypersensitivity: what do we know. Vet ImmunolImmunopathol. 147 (3-4), 113-126 (2012).
- Künzle, F., et al. IgE-bearing cells in bronchoalveolar lavage fluid and allergen-specific IgE levels in sera from RAO-affected horses. J Vet Med A PhysiolPatholClin Med. 54 (1), 40-47 (2007).
- Tahon, L., et al. In vitro allergy tests compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction. Vet ImmunolImmunopathol. (1-2), 85-93 (2009).
- Wagner, B., Radbruch, A., Rohwer, J., Leibold, W. Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the immunoglobulin heavy chain of native IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 92 (1-2), 45-60 (2003).
- Wilson, A. D., Harwood, L., Torsteinsdottir, S., Marti, E. Production of monoclonal antibodies specific for native equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with insect bite dermal hypersensitivity. Vet ImmunolImmunopathol. 112 (3-4), 156-170 (2006).
- McAleese, S. M., et al. Cloning and expression of the extra-cellular part of the alpha chain of the equine high-affinity IgE receptor and its use in the detection of IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 110 (1-2), 187-191 (2006).
- Ledin, A., et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine. 24 (1), 66-74 (2006).
- Siraganian, R. P., Hook, W. A. Histamine release and assay methods for the study of human allergy. Manual of Clinical Immunology. , (1980).
- Neuberger, M. S., et al. A hapten-specific chimaericIgE antibody with human physiological effector function. Nature. 314 (6008), 268-270 (1985).
- Bingham, B. R., Monk, P. N., Helm, B. A. Defective Protein Phosphorylation and Ca2+ Mobilization in a low secreting variant of the rat basophilic leukemia cell line. The Journal of Biological Chemistry. 269 (30), 19300-19306 (1994).
- McAleese, S. M., Halliwell, R. E., Miller, H. R. Cloning and sequencing of the horse and sheep high-affinity IgE receptor alpha chain cDNA. Immunogenetics. 1 (51), 878-881 (2000).
- Hongtu, Y. Study of the structure/function relationship in canine and human IgE as the basis for the development of rational therapeutic intervention strategies in allergic disease. , (2010).
- Sabban, S., et al. Towards a pan-anti-allergy vaccine. JIBTVA. 2 (2), 15-27 (2013).
- Moran, G., Burgos, R., Araya, O., Folch, H. In vitro bioassay to detect reaginic antibodies from the serum of horses affected with recurrent airway obstruction. Vet Res Commun. 34, 91-99 (2010).
