Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.
In this demonstration, spheroids formed from the β-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.
Um eine große Zahl von lebensfähigen und funktionellen humanen Zellen für eine Transplantation zu erzeugen, die Regulierung der Kulturbedingungen ist zwingend notwendig. Depletion von Nährstoffen sowie Anhäufung von Stoffwechselschlacken sind die Hauptursachen von Seneszenz und metabolischen Veränderungen, die die Qualität des Zellprodukt 1 reduzieren – 3. Dieses Verfahren veranschaulicht ein Verfahren zur Kultur von Säugerzellen in Sphäroide einen gerührten Bioreaktor mit einer eingestellten Rate Perfusion Zuführsystem Glukose zu regulieren in einem physiologischen Bereich 4 während der gesamten Dauer der Kultur kombiniert werden. Für den Zweck dieser Studien wurde die physiologischen Bereich zwischen 100 und 200 mg / dl definiert. Die gleichen Verfahren können verwendet werden, um andere Nährstoffe und Stoffwechselschlacken regulieren wie Lactat.
Statische Kulturen in kleinen Mengen (1 bis 30 ml) werden typischerweise in der Laborumgebung verwendet zu erhalten und Zelllinien für Experime differenzierenntal Zwecke. Zell Passagierung wird mit vollständigem Medium Änderungen durchgeführt, wie in regelmäßigen Abständen erforderlich. Die meisten "konventionellen" Kulturmedium hat eine hohe Glukosekonzentration (450 mg / dl für DMEM in diesen Studien verwendet) für weniger häufigen Medienwechsel, ohne das Risiko von Nährstoffbegrenzungen zu ermöglichen. Allerdings ist diese batch-Einspeisung Verfahren erfordert noch häufige Manipulation führt Variabilität in der Zellumgebung und erhöht das Risiko einer Kontamination von 5 bis 9. Gerührte Suspension Bioreaktoren (SSB) eine bessere Durchmischung sorgen und verringerte 3,10 Handhabung – 20, aber wie statische Kulturen, erfordern eine manuelle Medium Änderungen, die potenziell schädlichen Schwankungen Nährstoff- und Abfallprodukt Niveaus beitragen. Perfusions-Fütterung von SSB Kulturen reduziert diese Probleme durch eine kontinuierliche Infusion und Entfernung von Medium, aber große Veränderungen in der Nährstoffgehalt aufgrund des Zellwachstums bleiben ein Problem. Die Verwendung einer angepassten Fütterung rate aus Berechnungen der Nährstoffnutzung auf Basis der geschätzten Zell Anforderungen können die stabilen Zellumgebung bieten erforderlich die Lebensfähigkeit der Zellen zu optimieren und Funktion 21-24.
Es gibt eine große Menge an Literatur beschreibt Methoden für skalierbare SSB Kulturen von Säugetierzellen spezifisch für Kultur und Expansion von pluripotenten Zellen 25 – 32, mit anderen auf Insel konzentriert (beta) Zellen 17,33,34, oder die Produktion von biologischen Produkten 24, 35-38. Viele dieser untersuchten Zelltypen können in Sphäroid-Kulturen und spezifische Verfahren für den Zelltyp sollte die Implementierung einer kontinuierlichen Zuführungssystem vor optimiert werden verwendet wird gezüchtet werden. In dieser Demonstration wurde eine Perfusion Fütterungsmethode verwendet , um eine Beta – Zelllinie als Sphäroiden in einem gerührten Bioreaktor 39 gewachsen zu erweitern – 43. Das hier beschriebene Verfahren stellt eineinfache Implementierung Kursanpassungen der Fütterung auf Basis von Messungen off-line Glucose gezielte Kulturbedingungen zu erreichen. Einstellen der Vorschubgeschwindigkeit mit dieser Methode eine physiologische Zuckerspiegel aufrecht zu erhalten ist zu einem Anstieg Zellausbeuten gezeigt. Säugerzellen sind abhängig von einem Schlüsselnährstoff, Glukose, für die Energieproduktion, so dass die Verwendung dieser Zelllinie stellt ein Modell für viele kultivierten Säugetierzellen 44. Darüber hinaus beispielhaft für diese Linie die weitere Komplexität der Beta – Zellen, die Glukose zu chronisch hohen Niveaus von 45 empfindlich sind. Für diese Studie wurden β-TC6 Zellen erlaubt Sphäroide in der Kultur zu bilden , die durchschnittliche Größe der Langerhans'schen Inseln in vivo zu approximieren. Die Perfusionsbioreaktorsystem System 17 – 19,21,46 mit einer Vorschubgeschwindigkeit eingestellt Verbrauch zu Glukose, führte zu physiologischen Bedingungen zu erhalten und höhere Zellausbeuten ohne Veränderungen der Lebensfähigkeit.
Erzeugen von Säugerzellprodukten für die Herstellung von biologischen Wirkstoffen und für die Zelltherapie erfordert die Kultur und Überwachung von Säugetierzellen in großem Maßstab 55-58. Außerdem rufen diese Anwendungen für die Kulturbedingungen definiert und validiert. Erhöhung einfach das Volumen der Zellen Forschungstechnologien werden alle diese Anforderungen nicht erfüllen. Manuelle Medium Änderungen Schwankungen an Nährstoffen und Anhäufung von Abfallprodukten reduz…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Michael Garwood and Sam Stein for their helpful comments, and Kristen M. Maynard for assistance with manuscript preparation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number / Link | Comments/Description |
BTC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
DPBS No CA, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
DMEM High Glucose (500mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
DMEM Low Glucose (100mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
L-gultamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco – Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow , Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used | |
Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
1L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
2L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
Tissue Culture Dishes 100mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine, http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used, http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (eg. Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below | |
Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used, http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
Millipore Millex GP PES membrane 0.22ul sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
25ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
Trypan Blue | Gibco – Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used, https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |
One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |