Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.
Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.
Den inflammatoriska reaktionen på sjukdom eller skada i det centrala nervsystemet (CNS) är dåligt förstådd, särskilt med avseende på samspelet mellan immun och residensceller i vävnaden. Undersökningar av dessa cellulära interaktioner i ryggmärgen är av särskilt intresse i det levande djuret. Den enda lättillgänglig CNS vita substansen tarmkanalen är i de dorsala kolumnerna i ryggmärgen, vilket gör detta ett viktigt område som att koncentrera insatserna på att förbättra genomförbart experimentellt förhållningssätt. Dessa undersökningar har varit begränsade på grund av den tekniska svårigheter att få tillgång och stabilisera CNS för avbildning. Live avbildning i ryggmärgen har beskrivits tidigare 1-13 dock få studier har tagit upp cellulär rörelse i en ryggmärgsskada utöver några timmar efter den första förolämpning. Den traumatiska ryggmärgsskada är en komplex miljö, med neuron, astrocyter, fibroblaster, NG2 progenitorceller, och immunceller including mikroglia, neutrofiler, makrofager, T-celler, B-celler och dendritiska celler 14,15. Makrofager är den undergrupp av immunceller som är ansvariga för fagocytos i lesionen, infiltrerande från cirkulationen. Den roll som dessa fagocytceller har debatterats, med rapporter som indikerar att dessa celler kan ta på både skadliga och skyddande roller i den skadade vävnaden. Dessa roller allt från ökad sekundär axonal skogsskador efter en skada och agera på ett sätt fagocytisk 16-22, för att ta på en sårläknings fenotyp och minskande funktionella brister i den skadade djuret 21,23,24.
Tidigare försök att skilja makrofager från mikroglia har förlitat sig huvudsakligen på morfologi i frisk vävnad. Men aktiverade mikroglia och makrofager uttrycker många av samma markörer och visa oskiljbara morfologi efter skada 25-29, vilket gör separationen av olika aktiviteter i dessa celler är svåra att studera based på enbart 30 av dessa faktorer. Dessa celler kan separeras genom differentiell expression av CD45 genom att använda flödescytometri 33,34, även om detta tillvägagångssätt är mindre användbar vid diskriminera dessa celltyper in vivo. Använda differentiella uttryck av CCR2 och CX3CR1 i mikroglia och makrofager har också undersökts, även om de dynamiska förändringar i uttrycket av dessa markörer som monocyter differentierar till makrofager kan komplicera noggrann analys 35,36. Mikroglia är bosatta immunceller i CNS och härrör från gulesäcken stamceller under fosterutvecklingen, medan makrofager härrör från benmärgsstamfäder och ange den skadade CNS efter en förolämpning 31,32. Ett alternativt sätt att använda morfologi för att skilja dessa två celltyper är att ersätta benmärgen med stamceller från en donator djur som uttrycker en spårbar markör i makrofagerna härrör från donatorstamfäder, samtidigt som den CNS bosatt, recipient härledda mikroglia. Dessa benmärgs chimära modellerna vanligen används i många andra tillämpningar 37-40. Denna metod har unika förbehåll för de skador på integriteten hos blod-hjämbarriären orsakad av bestrålning eller cytotoxiska läkemedel som används för att utrota märg progenitorer i värden, vilket därmed begränsar dess användning i vissa tillämpningar. Nyligen, är funktionella skillnader mellan mikroglia och makrofager i CNS börjar urskiljas genom flödescytometri, genchip array analys och chimerism metoder 24,26,41-44, vilket kommer att vara mycket användbar i framtiden. Även separera dessa två celltyper är fortfarande svårt, är viktigt för att leda till mer riktade behandlingar av sjukdomar som involverar både mikroglia och makrofager inom CNS förstå deras unika funktioner.
Beskrivning av cellulära interaktioner inom ryggmärgen lesionen har främst kommit från studier som involverar cellodlingsmodeller. Detta är due till de utmaningar som med bild både ryggmärgsskada och immunceller tillsammans i ett levande djur. Nuvarande gnagare modeller av ryggmärgsskada av varierande typ och svårighetsgrad inkluderar kontusion modeller 45,46, pin-prick skador 2, skärsår 47 och rygg kolumnen krosskada beskrivs här 16,18,48. Inflammation i hjärnhinnorna ökar med skadornas och ställer unika utmaningar för implantation av fönster eller operationer för seriell avbildning. Några av dessa utmaningar omfattar infiltrationen av fagocytiska celler såväl som generering av fibrös vävnad över den kirurgiska platsen. Några av dessa frågor kan övervinnas genom att skapa mindre skador och täcker den exponerade ryggmärgen med nonimmunogena kirurgiskt förband mellan dura och paraspinous muskler för att möjliggöra efterföljande återöppnande kirurgi, som görs här för att studera rygg kolumnen krosskada . Förmågan att bilden endast den dorsala delen av spinnal sladden begränsar också valet av skada, eftersom kontusion modeller orsaka främst skador på centrala sladden, ofta skona den mest dorsala delen av dorsala kolonnerna, särskilt vid tidiga tidpunkter efter skada 45,49. Därför beskriver vi en enkel skada modell som ger en ren, repeterbar, rektangulärt formade lesion som är användbar både för observation av cellrörelse inom lesionen och för enkel kvantifiering av axonal position i förhållande till skadan.
Imaging interaktioner av olika celltyper i sitt eget teoretiska vävnader under efterföljande patologi i realtid har genererat stort intresse. Inom tätt nätverk av CNS, kontakt cell-cell och signalering med angränsande celler är viktiga för normal funktion och för att förstå CNS patologi. Här beskrev vi användning av 2-foton laser scanning mikroskopi för observation av cellulära rörelse inom en mekanisk skada i ryggmärgen. Förutom kvaliteten på kirurgi och vävnadspreparat, är mekanisk stabilitet av vävnaden av största vikt för framgångsrik tidsförlopp mikroskopi, särskilt isoleringen av ryggmärgen från att andas rörelseartefakt. Stabilitet kan bedömas genom att leta efter förflyttning av ryggmärgen under ett dissektionsmikroskop som motsvarar hjärtfrekvensen eller andning hos djuret. Stabilitet bör bedömas både under utförandet av operationen och även omedelbart innan avbildning. Om animal är inte stabil, justeringar bör göras för att placeringen och täthet av ryggmärgen klämmor. Celltypsspecifik fluorescerande reporter musmodeller kombination med benmärgs chimera tillvägagångssätt har tillåtit identifiering av monocytiska celler kontra mikroglia och axoner. Tidigare studier har visat att blod härrör monocyter och inte mikroglia är ansvariga för sekundär axonal skada efter trauma med hjälp av den metod som beskrivs här 43. Dextran konjugerade kärl färgämne möjliggör kärlidentifiering både att ge landmärken och att brott i kärlintegritet. Valet av den lämpliga fluorescerande reporter musmodell är kritisk för att möjliggöra en korrekt identifiering av de önskade celltyper, som skall avbildas.
Utveckling av modeller fluorescerande mus som är lämpliga för de studier som utförs är också kritisk till framgång för experiment. Skilja mellan de två fagocytiska populationer av CX3CR1 + / GFP </sup> Celler i CNS har traditionellt varit svårt. Som visas här, kan en gemensam immunologisk teknik, bestrålningstjänster chimärer, utnyttjas för att skilja radioresistenta, CNS-bosatt mikroglia från benmärgsmakrofager. Strålningsförfarandet har potential att skada blodhjärnbarriären och förändra cellfenotyper, så bör övervägas noggrant användning av denna modell. Omfattningen av dessa förändringar skiljer med strålningsdos samt längd återhämtningsperiod, och deras inverkan på olika inflammatoriska modeller har inte helt klarlagd. Effekterna av strålning på CNS blod-hjärnbarriären kan minimeras genom att skydda huvudet under bestrålning, och detta har visat sig minska cellinfiltration i ryggmärgen efter bestrålning, även om ryggmärgen inte direkt skärmad 52. Här har vi observerat att antalet celler som infiltrerar in i CNS vid steady state på grund av chimär generation är obetydlig i motsats till number av celler in lesionen. Andra alternativa modeller att överväga inkluderar läkemedelsinducerade chimärer 52 eller parabiotic musmodeller 53.
Här har vi lagt fram en specifik, enkel och reproducerbar liten skada modell som resulterar i en skada på ryggens vita substansen i ryggmärgen som är lätt att bilden med 2-foton mikroskopi. Denna metod ger också en kvantifierbar skada att analysera graden av axonal skogsskador i rygg kolumner som i litteraturen har tillsammans med kompletterande fast vävnadsanalys 16,18,43,48,54. I denna modell djur visar endast minimala underskott och kräver ingen särskild vård efter skada. Framtida studier där man använt de dorsala kolumnen krosskada och avbildningstekniker som beskrivs här kan vara kraftfulla screening verktyg för att bedöma effekten av behandling för ryggmärgsskada. Dessa behandlingar kan innefatta småmolekylinhibitorer, droger, cellprodukter, vävnadstransplantat och kombinato behandlings. Samspelet mellan makrofager, mikroglia och nervceller är också sannolikt att spela en roll i andra sjukdomsmodeller i ryggmärgen, inklusive multipel skleros, tumörer, meningit och amyotrofisk lateral skleros, och denna teknik kan vara användbar i studiet av dessa sjukdomar samt .
The authors have nothing to disclose.
The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick’s Foundation (A.Y.H.), Alex’s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle’s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
60mm2 petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
Falcon 40 um cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
1x15mL and 1x50mL conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
16 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
1ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
HBSS | Gibco | 1E+07 | For bone marrow isolation |
RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
30-gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9E+06 | For imaging |
4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
Reflex Clips, 7mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
Marcaine | Henry Schein | 6E+06 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mm NaCl | For surgery |
26.2 mM NaHCO3 | From Cold Spring Harbor Protocols | ||
2.5 mM KCl | |||
1 mM NaH2PO4 | |||
1.3 mM MgCl2 | |||
10 mM glucose | |||
TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |