न्यूरॉन्स की 3 डी इमेजिंग और विश्लेषण संक्रमित<em> Vivo</em> साथ<em> Toxoplasma gondii</em
Summary
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम दृश्य और encysting परजीवी और संक्रमित न्यूरॉन के बीच स्थानिक संबंधों के विश्लेषण में सक्षम बनाता है जो परजीवी Toxoplasma gondii, से संक्रमित चूहों से छवि 160 माइक्रोन मोटी मस्तिष्क वर्गों के लिए सक्षम थे।
Abstract
Toxoplasma gondii मनुष्यों और कृन्तकों सहित एक व्यापक मेजबान रेंज, के साथ एक लाचार, intracellular परजीवी है। दोनों मानव और कृन्तकों में, Toxoplasma मस्तिष्क में एक आजीवन लगातार संक्रमण स्थापित करता है। यह मस्तिष्क के संक्रमण विकासशील भ्रूण या इस तरह के दिमाग में एक्वायर्ड इम्यून डेफिसिएंसी सिंड्रोम (एड्स) के रोगियों के लिए इस झुकाव और दृढ़ता के रूप में प्रतिरक्षा में अक्षम व्यक्तियों में, सबसे असुरक्षित लोगों में स्पर्शोन्मुख है जबकि विनाशकारी तंत्रिका संबंधी रोग हो सकता है। इस प्रकार, यह brain- Toxoplasma बातचीत Toxoplasma द्वारा उत्पादित रोगसूचक रोग के लिए महत्वपूर्ण है, फिर भी हम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) और परजीवी की कोशिकाओं के बीच सेलुलर या आणविक बातचीत की कम समझ है कि स्पष्ट है। सीएनएस के माउस मॉडल में यह न्यूरॉन्स परजीवी बनी रहती है जिसमें कोशिकाओं रहे हैं कि 30 साल से अधिक के लिए जाना जाता रहा है टोक्सोप्लाज़मोसिज़, लेकिन बहुत कम जानकारी के बारे में जो उपलब्ध हैन्यूरॉन का हिस्सा आम तौर पर (सोमा, डेन्ड्राइट, अक्षतंतु) संक्रमित है और इस सेलुलर संबंध उपभेदों के बीच बदलता है। भाग में, इस कमी इमेजिंग की कठिनाई के माध्यमिक और एक जानवर से पूरे संक्रमित न्यूरॉन्स visualizing है। इस तरह की छवियों को आम तौर पर धारावाहिक सेक्शनिंग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या immunostaining के बाद confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged ऊतक की सिलाई की आवश्यकता होगी। कई तकनीकों के संयोजन से, यहाँ वर्णित विधि immunostaining के लिए आवश्यकता के बिना तीन आयामी दृश्य और व्यक्तिगत, लंबे समय से संक्रमित न्यूरॉन्स के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, की पहचान करने और अल्सर होते हैं कि छवि पूरे कोशिकाओं को मोटी वर्गों के उपयोग (160 माइक्रोन) में सक्षम बनाता है, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या धारावाहिक सेक्शनिंग और सिलाई। इस तकनीक का उपयोग करना, हम परजीवी और संक्रमित न्यूरॉन के बीच सेलुलर संबंध को समझने के लिए शुरू कर सकते हैं।
Introduction
इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए उच्च संकल्प, लाचार इंट्रासेल्युलर परजीवी Toxoplasma gondii से संक्रमित हैं कि व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की तीन आयामी चित्र प्राप्त करने के लिए है।
Toxoplasma अक्सर क्योंकि मनुष्यों और कृन्तकों भी शामिल है जो अपने बड़े मध्यवर्ती मेजबान श्रृंखला के सबसे सफल परजीवी में से एक माना जाता है। मनुष्य और कृन्तकों दोनों में, दूषित भोजन या पानी की घूस के माध्यम से तीव्र संक्रमण के बाद, Toxoplasma फार्म इसकी धीमी गति से नकल करने के लिए अपनी तेजी से नकल फॉर्म (tachyzoite) से परिवर्तित और encysting द्वारा सीएनएस के एक लगातार संक्रमण पैदा करने में सक्षम है (bradyzoite )। असुरक्षित व्यक्तियों में, इस अव्यक्त सीएनएस संक्रमण अपेक्षाकृत स्पर्शोन्मुख माना जाता है, लेकिन इस तरह एड्स रोगियों या प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के रूप में प्रतिरक्षा में अक्षम व्यक्तियों में, परजीवी के प्रत्यावर्तन घातक toxoplasmic इन्सेफेलाइटिस 1,2 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों हातंत्र अनजान बनी हुई है हालांकि Toxoplasma साथ अव्यक्त संक्रमण, कृन्तकों 3,4 में व्यवहार में बदलाव करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं दिखाया गया है।
हैरानी की बात है, CNS- Toxoplasma बातचीत के महत्व पर प्रकाश डाला इन आंकड़ों के बावजूद, अपेक्षाकृत छोटे से विशेष रूप से सेलुलर और आणविक स्तर पर, इस रिश्ते के बारे में जाना जाता है। मस्तिष्क-परजीवी बातचीत का भी सरल पहलुओं का अध्ययन करने की क्षमता टैकनोलजी सीमाओं के हिस्से में बाधा उत्पन्न कर दिया गया है। उदाहरण के लिए, काम के बहुमत न्यूरॉन्स अल्सर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) 5,6 के साथ किया गया है जारी रहती है जिसमें कोशिकाओं रहे हैं कि दिखा। ईएम उच्च संकल्प देता है, यह समय लेने वाली है, श्रम गहन, और महंगी है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) assays के हाल ही में ईएम 7 द्वारा किए गए कार्य की पुष्टि करने के confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया गया है। Assays के प्रदर्शन करने के लिए तकनीकी रूप से आसान है और अपेक्षाकृत सस्ती है, लेकिन अंडर करने के लिए इन तकनीकों का उपयोग कर रहे हैंtand पुटी और संक्रमित न्यूरॉन के बीच स्थानिक संबंध समय, तकनीकी रूप से कठिन लगता है, और बहुमूल्य जानकारी के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो धारावाहिक पुनर्निर्माण की आवश्यकता है। इस प्रकार, हम सीएनएस टोक्सोप्लाज़मोसिज़ के माउस मॉडल के साथ प्रयोग किया और अन्दर या immunohistochemistry (आईएचसी) के बिना छवि को संक्रमित न्यूरॉन्स की सम्पूर्णता के लिए हमें की अनुमति देता है कि हो सकता है एक तरीका विकसित किया है। एक ऐसी तकनीक विकसित करके, हम एक अपेक्षाकृत जल्दी और सस्ता तरीके से संक्रमित कोशिका और पुटी के बीच सेलुलर संबंधों का पता लगाने के लिए शुरू कर सकते हैं।
हम पद्धति विकसित परजीवी प्रोटीन 9,10 इंजेक्शन के साथ किया गया है कि इन विवो कोशिकाओं में निशान जो एक प्रणाली के साथ confocal माइक्रोस्कोपी 8 से ऑप्टिकली समाशोधन और इमेजिंग मोटी मस्तिष्क वर्गों के लिए नई तकनीकों को जोड़ती है। इस प्रणाली में, हम Toxoplasma साथ पुनर्संयोजन 11 Cre की मध्यस्थता के बाद ही एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त कि रचनात्मक संवाददाता चूहों को संक्रमित </em> एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) को व्यक्त करने और मेजबान कोशिकाओं 9 में Cre recombinase इंजेक्षन कि उपभेदों। इस संयोजन सीएनएस संक्रमण की स्थापना की है के बाद, संक्रमित माउस मस्तिष्क फसल मोटी मस्तिष्क वर्गों में कटौती, और तेजी से आरएफपी + अल्सर खोजने के द्वारा छवि के लिए प्रासंगिक क्षेत्रों की पहचान करने के लिए हमें की अनुमति देता है। यह GFP के मेजबान सेल अभिव्यक्ति GFP + कोशिकाओं के एक नंबर परजीवी 10 शामिल नहीं है, संक्रमण पर परजीवी द्वारा Cre के इंजेक्शन पर पूरी तरह से निर्भर करता है, और के रूप में नहीं है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य छवि पूरे संक्रमित न्यूरॉन्स के लिए सक्षम होने के लिए है, ध्यान ही + GFP भी एक आरएफपी + पुटी होते हैं कि न्यूरॉन्स पर है, लेकिन प्रोटोकॉल भी छवि के लिए + GFP / आरएफपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है – न्यूरॉन्स।
संक्रमित मस्तिष्क काटा और sectioned है एक बार, वर्गों ग्लिसरॉल समाशोधन द्वारा पारदर्शी प्रदान कर रहे हैं। वर्गों का उचित क्षेत्रों तो confocal माइक्रोस्कोपी, अल साथ imaged हैंसंक्रमित मेजबान कोशिकाओं और अपनी संपूर्णता में encysted परजीवी के lowing अभूतपूर्व दृश्य। यहाँ हम एक की पहचान करने के लिए पूरा प्रोटोकॉल, ऑप्टिकली समाशोधन, और इमेजिंग संक्रमित न्यूरॉन्स प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
संक्रमित मेजबान कोशिकाओं में सेलुलर परिवर्तन ऐसे एचआईवी, रेबीज, और क्लैमाइडिया 18,19 के रूप में अन्य इंट्रासेल्युलर जीवों के साथ संक्रमण में इस रोग के परिणामों से जोड़ा गया है यह देखते हुए कि, हम हमार…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए पूरे कोशी प्रयोगशाला धन्यवाद। हम पैटी Jansma और सलाह के लिए एरिजोना के तंत्रिका विज्ञान विभाग के विश्वविद्यालय धन्यवाद और इमेजिंग के साथ मदद की। हम भी उनके Vibratome के उपयोग के लिए Porreca प्रयोगशाला धन्यवाद। इस शोध अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच NS065116, AAK) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| 200mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible – used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
Referências
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