Измерение мРНК темпы разложения в<em> Saccharomyces Cerevisiae</em> Использование<em> Rpb1-1</em> Штаммы
Summary
Устойчивый государственный уровень специфических мРНК определяется скоростью синтеза и распада мРНК. По всему геному темпы деградации мРНК или нормы распада специфических мРНК может быть измерена путем определения мРНК полураспада. Этот протокол фокусируется на измерении скорости распада мРНК в Saccharomyces CEREVISIAE.
Abstract
мРНК уровни стационарные варьируются в зависимости от условий окружающей среды. Регулирование устойчивых уровней накопления государство мРНК гарантирует, что нужное количество белка синтезируется для конкретных условий роста клетки. Один из подходов для измерения скорости распада мРНК ингибирования транскрипции и затем мониторинг исчезновение уже присутствующего мРНК. Скорость распада мРНК может быть количественно и точное время полужизни может быть определено с использованием нескольких методов. В S. Cerevisiae, протоколы, которые измеряют мРНК полураспада были разработаны и включают в себя ингибирования транскрипции мРНК с использованием штаммов, которые укрывают чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II, rpb1-1. Другие методы измерения мРНК наполовину жизни включают ингибирующие транскрипцию с транскрипционными ингибиторов, таких как thiolutin или 1,10-фенантролина, или альтернативно, используя мРНК, которые находятся под контролем регулируемого промоторатаких, как галактоза индуцируемого промотора и-офф ТЕТ системы. Здесь мы описываем измерение S. скорость распада CEREVISIAE мРНК с использованием чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II. Этот метод может быть использован для измерения мРНК скорости распада отдельных мРНК или генома.
Introduction
Транскрипции и распад мРНК специфическими являются важными детерминантами генной экспрессии. Скорость синтеза и распада специфических мРНК определяет стационарный уровень этой конкретной мРНК. Стационарное состояние уровни мРНК регулируют изобилие мРНК и определить, сколько каждого мРНК доступна для синтеза белка. Измерения мРНК полураспада широко используются для определения скорости распада мРНК. Удельный распада мРНК с различной скоростью, которые связаны с особенностями мРНК, в зависимости от белка, кодируемого мРНК и от условий окружающей среды. В зависимости от техники, используемой для определения скорости распада мРНК, измерения скорость распада может быть определена глобально или для отдельных транскриптов. В дрожжах S. Cerevisiae, методы, которые наиболее часто используются для измерения скорости распада глобальной мРНК включать в себя использование штамм дрожжей, несущих чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II и химической Закавкriptional ингибиторы, такие как thiolutin и 1,10-фенантролина 1-5. Эти методы также могут быть использованы для измерения скорости распада мРНК отдельные 4. Другие способы также могут быть использованы для измерения скорости распада мРНК. Эти методы включают в себя подход к стационарного маркировки или использования молекул мРНК, которые выражаются с регулируемой промотором, который выражается только в некоторых условиях. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки. Методика описана здесь использует чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II. Этот метод использует S. CEREVISIAE в качестве модели, но может были изменены и использованы в других системах с использованием специфических методик транскрипции ингибирования 6.
мРНК измерения периода полураспада, использующие чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II широко используются для обоих генома и физических измерений мРНК распада 4-5. Этот метод требует использование specifIC штамм дрожжей, которые таит в себе чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II, rpb1-1 1. Основанием для этого метода является то, что воздействие на чувствительный к температуре штамма дрожжей к непермиссивной температуры ингибирует синтез мРНК. Впоследствии, распад мРНК существовавшие ранее контролируется в различные моменты времени после транскрипции был запрещено. Исчезновение существовавшие ранее мРНК контролируется путем экстракции РНК из дрожжевых клеток в различные моменты времени после транскрипции был выключен. Моменты времени, в котором дрожжевые клетки собирают предопределены пилотного эксперимента, и зависят от стенограммы и системы ведется расследование. Быстрее моменты времени используются для короткоживущих транскриптов, в то время как более длинные временные точки используются для более долгоживущими транскриптов. После распада мРНК контролируется либо северной блот анализа, количественной ПЦР или RNAseq.
Измерение мРНК полураспада, используя TEmperature чувствительны аллель РНК-полимеразы II имеет свои преимущества. Во-первых, эта техника легко и прямо вперед. Во-вторых, после того, как штамм дрожжей приобретается или генерируется в лаборатории измерения периода полураспада мРНК может быть определена в различных условиях роста; позволяет определить влияния окружающей среды на мРНК распада. В-третьих, скорость распада мРНК может контролироваться генома. Использование других методов ингибирования транскрипции также имеет свои преимущества и недостатки. Например, использование индуцируемого промотора требуется субклонирования, чтобы генерировать мРНК, которое под контролем регулируемого промотора. Thiolutin не легко доступны и дорого если таковые имеются. Кроме того, режим thiolutin по действию не полностью понимали, и было сообщено, чтобы влиять на другие клеточные процессы, включая ингибирования мРНК распада 7. В качестве альтернативы, 1,10-фенантролина, более легко доступны. Кроме того, все методы, используемые для ингибирования транскрипции может ПертУРБ клеточную функцию и может влиять на различные мРНК в различных направлениях. Следователь должен определить наиболее подходящий метод для использования в своих экспериментальных условиях для достижения наиболее надежные результаты. Чтобы определить, какой метод является наиболее подходящим для их применения, исследователь должен определить стенограммы и функции белков, кодируемых транскриптов ведется расследование. Наиболее надежные измерения скорости мРНК распада являются те, которые определяются с помощью нескольких методов и показать такую же скорость распада. Ни один метод не всегда лучше, и наиболее подходящий метод зависит от конкретной ситуации.
Многочисленные исследования, проведенные в S. Cerevisiae измерили скорость распада мРНК в различных условиях и генетического происхождения. Условия что ставки мРНК распада, измеряемые в зависимости от конкретных эксперимент ведется расследование. Измерение скорости распада мРНК в различных клеточных средах определяет, являются ли условия бытияобследованных преимущественно влияют на скорость распада конкретных мРНК. Скорости распада мРНК может также варьировать в зависимости от штамма дрожжей используется. Например, скорость распада мРНК может быть определена в дрожжевых клетках дикого типа и клеток дрожжей с нефункциональной бред-опосредованной деградации мРНК (NMD) пути. Эта мРНК путь деградации встречается во всех эукариотических организмов, которые были изучены до сих пор и это вызывает деградацию мРНК, которые досрочно прекратить перевод 8. ПРО изначально определен как путь, который ухудшает мРНК с преждевременным кодонов терминации или бессмысленных кодонов, но в настоящее время признается в качестве пути, который также регулирует экспрессию не-глупости, содержащих природные мРНК. мРНК, которые стали целями пути быстро деградируют в дрожжевых клетках с функциональным ПРО пути и стабилизируется в дрожжевых клетках с нефункциональном ПРО пути. Таким образом, период полураспада мРНК, которые являются прямыми целями этого пути короче в дикого типа дрожжей челLs по сравнению с дрожжевых клеток с нефункциональной ПРО пути.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ингибирование синтеза мРНК и мониторинга оборот мРНК в отсутствии нового синтеза является метод, который часто используется для измерения скорости распада мРНК. В S. CEREVISIAE, измерение скоростей мРНК распада путем ингибирования транскрипции с использованием чувствительный к темпе…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
Referências
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
