Die Messung der mRNA-Abbau Preise in<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Verwenden<em> Rpb1-1</em> Die Stämme
Summary
Die Steady-State-Level spezifischer mRNAs wird durch die Geschwindigkeit der Synthese und der Zerfall der mRNA bestimmt. Genomweite mRNA Abbauraten oder die Zerfallsraten spezifischer mRNAs kann durch Bestimmung mRNA Halbwertszeiten gemessen werden. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Messung der mRNA-Zerfallsraten in Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
mRNA stationären Ebenen je nach Umgebungsbedingungen abhängig. Regulierung der stationären Aufstau einer mRNA stellt sicher, dass die korrekte Menge an Protein für die Zelle spezifische Wachstumsbedingungen synthetisiert. Ein Ansatz zum Messen der mRNA Zerfallsraten ist die Hemmung der Transkription und in der Folge der Überwachung des Verschwindens des bereits vorhandenen mRNA. Die Rate der mRNA-Zerfall kann dann quantifiziert werden, und eine genaue Halbwertszeit bestimmt werden kann unter Verwendung verschiedener Techniken. In S. cerevisiae, Protokolle, die mRNA Halbwertszeiten wurden entwickelt, messen und zählen Hemmung der Transkription der mRNA unter Verwendung von Stämmen, die ein temperaturempfindliches Allel von RNA-Polymerase II, rpb1-1 Hafen. Andere Techniken zum Messen mRNA-Halbwertszeiten umfassen Hemmung der Transkription mit Transkriptionsinhibitoren wie thiolutin oder 1,10-Phenanthrolin, oder alternativ durch Verwendung von mRNAs, die unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotorswie die Galactose induzierbaren Promotor und dem TET-off-System. Hier haben wir Messung S. beschreiben cerevisiae mRNA Zerfallsraten mit Hilfe der temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II. Diese Technik kann verwendet werden, um mRNA-Zerfallsraten einzelner mRNAs oder genomweiten messen.
Introduction
Die Transkription und Zerfall von spezifischen mRNA sind entscheidende Parameter der Genexpression. Die Rate der Synthese und Zerfall von spezifischen mRNAs bestimmt die Steady-State-Ebene des jeweiligen mRNA. Die stationären Mengen an mRNAs regeln die Fülle von mRNAs und bestimmen, wie viel von jeder mRNA zur Proteinsynthese zur Verfügung steht. Messungen der mRNA Halbwertszeiten werden in großem Umfang verwendet, um die Zerfallsrate von mRNAs zu bestimmen. Spezifische mRNAs Zerfall mit unterschiedlichen Raten, die sich auf Merkmale der mRNA, die die Funktion des Proteins von der mRNA und den Umgebungsbedingungen codiert verwandt sind. Abhängig vom verwendeten mRNA Zerfallsraten bestimmen Technik kann Abklingrate Messungen bestimmt werden entweder global oder für einzelne Transkripte. In der Hefe S. cerevisiae, die Techniken, die am häufigsten verwendet werden, um globale mRNA Zerfallsraten zu messen, umfassen die Verwendung eines Hefe-Stamm, der die temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II und chemische Funkgeräteriptional Inhibitoren wie thiolutin und 1,10-Phenanthrolin-1-5. Diese Methoden können auch verwendet werden, um einzelne mRNA Abklingraten 4 messen. Andere Verfahren können auch verwendet werden, um mRNA Zerfallsraten zu messen. Diese Methoden umfassen Ansatz zur stationären Kennzeichnung oder Verwendung von mRNA-Molekülen, die von einem regulierten Promotor, die für ausgewählte Bedingungen exprimiert wird, exprimiert werden. Jede dieser Techniken hat bestimmte Vor- und Nachteile. Die hier beschriebene Technik verwendet die temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II. Dieses Verfahren verwendet S. cerevisiae als Modell, kann aber unter Verwendung spezifischer Transkriptionshemmung Techniken 6 geändert und in anderen Systemen genutzt werden.
mRNA-Halbwertszeit-Messungen unter Verwendung des temperaturempfindlichen Allel von RNA-Polymerase II werden ausgiebig sowohl für genomweiten und individuellen Messungen der mRNA-Zerfall 4-5 verwendet. Diese Technik erfordert die Verwendung einer spezific Hefestamm, der ein temperaturempfindliches Allel von RNA-Polymerase II, rpb1-1 1 beherbergt. Der Grund für dieses Verfahren ist, dass die Exposition der temperaturempfindlichen Hefestamm auf die nicht-permissive Temperatur hemmt mRNA-Synthese. Anschließend wird Verfall der bereits vorhandenen mRNA zu verschiedenen Zeitpunkten überwacht nach der Transkription wurde inhibiert. Das Verschwinden von dem vorher existierenden mRNA wird durch Extrahieren von RNA aus den Hefezellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transkription abgeschaltet wurde überwacht. Die Zeitpunkte, an denen die Hefezellen geerntet werden von einem Pilotversuch vorbestimmten, und hängen von der Transkripte und untersuchten System. Schnellere Zeitpunkte werden für kurzlebige Transkripte verwendet, während längere Zeit Punkte werden für länger gelebt Transkripte verwendet. Danach wird der Zerfall der mRNA entweder durch Northern Blot-Analyse, quantitative PCR oder RNAseq überwacht.
Die Messung der mRNA Halbwertszeiten mit einem temperature empfindliche Allel von RNA-Polymerase II hat seine Vorteile. Erstens ist dieses Verfahren einfach und geradlinig. Zweitens, wenn der Hefestamm erfasst oder im Labor die mRNA-Halbwertszeit-Messungen in unterschiedlichen Wachstumsbedingungen bestimmt werden, erzeugt werden; ermöglicht die Bestimmung von Umwelt Einfluss auf mRNA-Zerfall. Drittens kann mRNA Zerfallsraten überwacht werden genomweite. Die Verwendung anderer Transkriptionshemmung Techniken hat auch Vorteile und Grenzen. Zum Beispiel kann die Verwendung eines induzierbaren Promotors erfordert Subklonierung zu einer mRNA, die unter der Kontrolle der regulierten Promotor zu erzeugen. Thiolutin ist nicht leicht erhältlich und teuer ist, wenn verfügbar. Zusätzlich wird Wirkungs thiolutin die nicht vollständig verstanden, und es wurde berichtet, dass andere zelluläre Prozesse, einschließlich Hemmung der mRNA-Zerfall 7 beeinflussen. Alternativ, 1,10-Phenanthrolin, ist leicht verfügbar. Ferner sind alle der Techniken verwendet werden, um Transkription zu hemmen, kann perturb Zellfunktion und kann verschiedene mRNAs in unterschiedlichen Weisen beeinflussen. Ein Ermittler muss die am besten geeignete Methode, um in ihren experimentellen Bedingungen nutzen, um die zuverlässigsten Ergebnisse erreichen zu bestimmen. Zu bestimmen, welche am besten geeignete Verfahren für ihre Anwendung ist, muss ein Forscher, die Transkripte und die Funktion der Proteine, die von den Transkripten kodiert suchten identifizieren. Die zuverlässigsten mRNA-Zerfall Leistungsmessungen sind diejenigen, die verwenden, bestimmt mehrere Techniken und zeigen dieselbe Abbaurate. Keine dieser Techniken ist immer die beste, und die am besten geeignete Technik, hängt von der speziellen Situation.
Zahlreiche Studien in S. cerevisiae haben mRNA Zerfallsraten in verschiedenen Bedingungen und genetischen Hintergründen gemessen. Die Bedingungen, die mRNA-Zerfall Preise sind in Mess hängen von der spezifischen Experiment untersucht. Mess mRNA Zerfallsraten in verschiedenen zellulären Umgebungen bestimmt, ob die Bedingungen, dasssuchten bevorzugt Einfluss auf die Zerfallsraten spezifischer mRNAs. Die Dämpfungsraten von mRNAs kann auch in Abhängigkeit von den Hefestamm je benutzt. Beispielsweise kann mRNA Zerfallsraten in Wildtyp-Hefezellen und Hefezellen mit einer nicht funktionsfähig Nonsense-vermittelten mRNA-Abbau (NMD) Weg bestimmt werden. Diese mRNA Abbauweg in allen eukaryontischen Organismen, die bisher untersucht wurden, gefunden, und es den Abbau von mRNAs, die vorzeitig zu beenden Übersetzung 8 auslöst. NMD wurde ursprünglich als ein Weg, der mRNAs mit vorzeitigen Stoppcodons oder Nonsense-Codons abbaut identifiziert, aber wird jetzt als ein Weg, der auch die Expression von nicht-Unsinn mit natürlichen mRNAs anerkannt. mRNAs, die als Ziele der Bahn sind, werden rasch in Hefezellen, die mit einem funktionellen NMD Weg abgebaut und in Hefezellen, die mit einem nicht-funktionellen NMD Wegs stabilisiert. So sind die Halbwertszeiten der mRNAs, die direkte Ziele dieses Weges sind in Wildtyp-Hefe cel kürzerls gegenüber Hefezellen mit einer nicht funktionsfähig NMD Weg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemmung der mRNA-Synthese und mRNA Überwachung Umsatz in der Abwesenheit von neuen Synthese ist ein Verfahren, das häufig verwendet wird, um die mRNA-Abbauraten zu messen. In S. cerevisiae, ist die Messung der mRNA Zerfallsraten durch Hemmung der Transkription unter Verwendung der temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II eine der am häufigsten verwendeten Methoden. Dieses Verfahren hemmt spezifisch die RNA-Polymerase II. Die wichtigsten Schritte zur Bestimmung von mRNA-Abbauraten mit dieser Technik…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
Referências
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