Meting van mRNA Decay tarieven in<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Het gebruik van<em> Rpb1-1</em> Stammen
Summary
Het steady state niveau van specifieke mRNA's wordt bepaald door de snelheid van synthese en afbraak van het mRNA. Genoom-brede mRNA degradatie tarieven of de vervalsnelheid van specifieke mRNA's kan worden gemeten door het bepalen van mRNA halfwaardetijden. Dit protocol richt zich op het meten van mRNA vervalsnelheden in Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
mRNA steady state niveaus variëren, afhankelijk van de omgevingsomstandigheden. Regulering van de steady state niveaus accumulatie van mRNA zorgt dat de juiste hoeveelheid eiwit wordt gesynthetiseerd specifieke groeiomstandigheden van de cel. Eén benadering voor het meten van mRNA afstandsdempingssnelheden is remmen transcriptie en daaropvolgende toezicht het verdwijnen van de reeds aanwezige mRNA. Het tarief van mRNA verval kan dan worden gekwantificeerd, en een nauwkeurige halfwaardetijd kan worden bepaald met behulp van verschillende technieken. In S. cerevisiae, protocols die mRNA halfwaardetijden ontwikkeld meten en omvat de inhibitie transcriptie van mRNA met stammen die een temperatuur gevoelige allel van RNA polymerase II, rpb1-1 haven. Andere technieken voor het meten van mRNA halfwaardetijden omvatten remmende transcriptie met transcriptie- remmers zoals thiolutin of 1,10-fenantroline, of alternatief door gebruik mRNAs die onder de controle van een reguleerbare promoterzoals galactose induceerbare promoter en de TET-off systeem. We beschrijven hier meting van S. cerevisiae mRNA decay rates met behulp van de temperatuur gevoelige allel van RNA-polymerase II. Deze techniek kan worden gebruikt om mRNA afstandsdempingssnelheden van afzonderlijke mRNA of genoom-brede meten.
Introduction
De transcriptie en het verval van specifieke mRNA zijn cruciaal determinanten van genexpressie. De snelheid van synthese en afbraak van specifieke mRNAs bepaalt de steady-state niveau van dat mRNA. De steady state niveaus van mRNA regelen de overvloed aan mRNA en bepalen hoeveel van elk mRNA beschikbaar voor eiwitsynthese. Metingen van mRNA halfwaardetijden worden op grote schaal gebruikt om de vervalsnelheid van mRNA's te bepalen. Specifieke mRNA verval verschillende tarieven die betrekking hebben op functies van het mRNA, de functie van het eiwit gecodeerd door het mRNA en de omgevingsomstandigheden. Afhankelijk van de techniek gebruikt om mRNA verval tarieven te bepalen, kan vervalsnelheid metingen worden bepaald, hetzij globaal of voor afzonderlijke transcripten. In de gist S. cerevisiae, de technieken die het meest worden gebruikt om globale mRNA vervalsnelheden meten onder andere gebruik te maken van een giststam die het op temperatuur gevoelige allel van RNA-polymerase II en chemische transcytoseriptional remmers zoals thiolutin en 1,10-fenantroline 1-5. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om individuele mRNA afstandsdempingssnelheden 4 meten. Andere werkwijzen kunnen ook worden gebruikt om mRNA vervalsnelheid meten. Deze werkwijzen omvatten benadering steady state etikettering of gebruik van mRNA-moleculen die tot expressie van een gereguleerde promoter die expressie alleen in bepaalde omstandigheden. Elk van deze technieken heeft bepaalde voordelen en beperkingen. De hier beschreven techniek maakt gebruik van de temperatuur gevoelige allel van RNA polymerase II. Deze methode maakt gebruik van S. cerevisiae als model, maar kan gewijzigd en gebruikt in andere systemen met specifieke transcriptionele remming technieken 6.
mRNA halfwaardetijd metingen met behulp van de temperatuur gevoelige allel van RNA-polymerase II worden veel gebruikt voor zowel genoom-brede en individuele metingen van mRNA verval 4-5. Deze techniek vereist het gebruik van een specific giststam die een temperatuur gevoelige allel van RNA-polymerase II, rpb1-1 1 herbergt. De reden voor deze techniek is dat blootstelling van de temperatuur gevoelige giststam de permissieve temperatuur remt synthese van mRNA. Vervolgens wordt verval van de reeds bestaande mRNA gecontroleerd op verschillende tijdstippen na de transcriptie werd geremd. Het verdwijnen van de reeds bestaande mRNA wordt gevolgd door extractie van RNA uit de gistcellen op verschillende tijdstippen na transcriptie is uitgeschakeld. De tijdstippen waarop de gistcellen geoogst worden bepaald door proeffase, en afhankelijk van de transcripties en systeem onderzocht. Snellere tijdstippen worden gebruikt voor korte duur transcripties, terwijl langere tijdstippen worden gebruikt voor langere woonde transcripties. Daarna wordt het verval van het mRNA gevolgd door een Northern blot analyse, kwantitatieve PCR of RNAseq.
Meting van mRNA halfwaardetijd met een temperature gevoelige allel van RNA-polymerase II heeft zo zijn voordelen. Ten eerste, deze techniek is eenvoudig en ongecompliceerd. Ten tweede, wanneer de giststam wordt verkregen of geproduceerd in het laboratorium de mRNA halfwaardetijd metingen kunnen verschillende kweekomstandigheden te bepalen; waardoor de bepaling van milieu-invloed op mRNA verval. Ten derde kan mRNA vervalsnelheden worden gecontroleerd genome-wide. Het gebruik van andere transcriptie remming technieken heeft ook voordelen en beperkingen. Bijvoorbeeld, het gebruik van een induceerbare promoter vereist subklonering van een mRNA dat onder controle van de gereguleerde promoter genereren. Thiolutin is niet direct beschikbaar en is duur, indien beschikbaar. Bovendien wordt werkingswijze thiolutin's niet volledig begrepen en er is gemeld beïnvloeden andere cellulaire processen waaronder remmen mRNA verval 7. Alternatief, 1,10-fenantroline, gemakkelijker beschikbaar. Bovendien alle technieken om transcriptie te remmen kan pertURB cellulaire functie en kan invloed hebben op verschillende mRNA's in verschillende manieren. Een onderzoeker moet de meest geschikte methode te gebruiken in hun experimentele omstandigheden de meest betrouwbare resultaten te bereiken bepalen. Om te bepalen welke methode het meest geschikt is voor hun toepassing, een onderzoeker moet de transcripten en de functie van de eiwitten waarvoor de transcripten onderzocht identificeren. De meest betrouwbare mRNA vervalsnelheid metingen zijn die zijn bepaald met behulp van meerdere technieken en vertonen dezelfde vervalsnelheid. Één techniek altijd de beste en de meest geschikte techniek afhankelijk van de specifieke situatie.
Talrijke studies in S. cerevisiae hebben mRNA vervalsnelheden gemeten in verschillende omstandigheden en genetische achtergronden. De voorwaarden die mRNA afstanddemping gemeten afhankelijk van het specifieke experiment onderzocht. Het meten van mRNA vervalsnelheden in verschillende cellulaire omgevingen bepaalt of aan de voorwaarden wordtonderzocht bij voorkeur van invloed op de vervalsnelheid van specifieke mRNA's. De vervalsnelheid van mRNA's kunnen ook variëren afhankelijk van de giststam wordt gebruikt. Bijvoorbeeld kan mRNA vervalsnelheden bepaald wild-type gistcellen en gistcellen met een functioneel-nonsense gemedieerde mRNA afbraak (NMD) route. Dit mRNA afbraak route is te vinden in alles wat tot nu toe zijn onderzocht eukaryote organismen en activeert het de afbraak van mRNA's die voortijdig beëindigen vertaling 8. NMD werd aanvankelijk geïdentificeerd als een traject dat mRNA teruglopen bij voortijdige beëindiging codons of nonsense codons, maar wordt nu erkend als een pad dat ook de expressie van niet-nonsense bevattende natuurlijk mRNA. mRNA dat zijn doelwit van de route worden snel afgebroken in gistcellen met een functionele NMD route en gestabiliseerd in gistcellen met een niet-functionele NMD pad. Zo is de halfwaardetijden van mRNA dat de directe doelstellingen van deze route zijn korter zijn, wild-type gist cells vergeleken gistcellen met een functioneel NMD route.
Protocol
Representative Results
Discussion
Remming van mRNA-synthese en controle in de afwezigheid van nieuwe synthese mRNA omzet een werkwijze die vaak wordt gebruikt om mRNA vervalsnelheid meten. In S. cerevisiae, meting van mRNA dempingssnelheden door remming van transcriptie met het temperatuurgevoelige allel van RNA polymerase II is een van de meest gebruikte methoden. Deze werkwijze remt specifiek RNA polymerase II. De belangrijkste stappen voor het bepalen van mRNA dempingssnelheden deze techniek zijn: 1) Voorafgaand aan het oogsten van de gistce…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
Referências
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
