MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em> Saccharomyces cerevisiae</emKullanma><em> Rpb1-1</em> Suşlar
Summary
Belirli mRNA'ların sabit durum seviyesi mRNA sentezi ve çürüme oranı ile tespit edilir. Genom mRNA azalma oranları ve özel mRNA bozunma oranları mRNA'nın yarı ömürleri saptanmasıyla ölçülebilir. Bu protokol Saccharomyces cerevisiae mRNA bozunma oranlarının ölçümü üzerinde duruluyor.
Abstract
mRNA kararlı durum düzeyleri çevresel koşullara bağlı olarak değişir. Bir mRNA'nın kararlı durum birikimi seviyelerinin düzenlenmesi proteinin doğru miktarı, hücrenin özel büyüme koşulları için sentez edilmesini sağlar. MRNA bozulma oranlarını ölçmek için bir yaklaşım transkripsiyonu inhibe ve daha sonra zaten mevcut mRNA kaybolması izleme olduğunu. mRNA azalma oranını daha sonra tayin edilebilir ve doğru bir yarı ömür çeşitli teknikler kullanılarak tespit edilebilir. S. cerevisiae yarı ömürleri geliştirilmiştir mRNA ölçmek ve RNA polimeraz II, rpb1-1 bir sıcaklığa duyarlı allel liman suşları kullanılarak mRNA'nın transkripsiyonunu inhibe içerir protokolleri. Bir düzenlenebilir promoterin kontrolü altında kodlayan mRNA kullanılarak yarı ömürleri gibi alternatif thiolutin veya 1,10-fenantrolin gibi veya kopyalama önleyicileri ile transkripsiyonu inhibe içerir mRNA ölçmek için diğer teknikler,Bu tür galaktoz ile uyarılabilir promoteri ve TET off sistemi. Burada, biz S. ölçümü tanımlamak RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile cerevisiae mRNA bozunma oranları. Bu teknik, tek tek mRNA ya da genom çapında mRNA bozunma hızını ölçmek için kullanılabilir.
Introduction
transkripsiyon ve spesifik mRNA bozunma gen ekspresyonunun önemli belirleyicilerdir. sentez ve özel mRNA'ların çürüme oranı o mRNA kararlı durum seviyesini belirler. mRNA'lann kararlı durum düzeyleri mRNA bereket yöneten ve protein sentezi için ne kadar her mRNA belirler. MRNA yarı hayatımızın Ölçümler mRNA çürüme hızını belirlemek için yoğun olarak kullanılmaktadır. MRNA, mRNA ve çevre koşulları ile kodlanan proteinin fonksiyon özellikleri ile ilgili farklı oranlarda özel mRNA'lar bozunma. MRNA bozulma oranlarını belirlemek için kullanılan tekniğe bağlı olarak, çürüme hızı ölçümleri ya küresel ya da bireysel transkript için tespit edilebilir. Maya S. olarak cerevisiae, yaygın genel mRNA bozulma oranını ölçmek için kullanılan teknikler, RNA polimeraz II ve kimyasal transkripsivonel sıcaklığa duyarlı allel barındıran bir maya suşu kullanılarak içerirBu tür thiolutin ve 1,10-fenantrolin 1-5 gibi riptional inhibitörleri yer alır. Bu yöntemler ferdi mRNA bozunma hızını 4 ölçmek için kullanılabilir. Diğer yöntemler, ayrıca, mRNA'nın bozunma hızını ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntemler, kararlı durum etiketleme veya yalnızca belirli koşullarda eksprese edilen bir düzenlenmiş arttırıcının eksprese edilen mRNA moleküllerinin kullanımına yolla uygulanabilir. Bu tekniklerin her biri belirli avantajlara ve sınırlamalar vardır. Burada anlatılan teknik, RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel kullanmaktadır. Bu yöntem, S. kullanır cerevisiae modeli olarak, spesifik transkripsiyon inhibisyon teknikleri 6 kullanan diğer sistemlerde değiştirilmiş ve kullanılmıştır ama.
RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile mRNA yarı ömrü ölçümleri kapsamlı mRNA bozulma 4-5 iki genom ve tek tek ölçümler için kullanılmıştır. Bu teknik, bir Belir kullanımını gerektirirRNA polimeraz II, rpb1-1 1 'in bir sıcaklığa duyarlı allel barındırır ic maya suşu. Bu teknik için mantık infeksiyona izin vermeyen sıcaklık sıcaklığa duyarlı maya soyunun maruz mRNA sentezini inhibe olmasıdır. Transkripsiyon inhibe sonra Daha sonra, önceden mevcut olan mRNA çürüme farklı zaman noktalarında izlenir. önceden var olan mRNA kaybolması transkripsiyon kapatıldıktan sonra farklı zaman noktalarında, maya hücrelerinden RNA ekstre ederek izlenir. maya hücreleri hasat olduğu zaman noktaları pilot deney tarafından önceden belirlenmiş ve transkript ve sistem araştırılıyor bağlıdır edilmektedir. Daha uzun bir zaman noktaları uzun yaşayan transkript için kullanılır ise daha hızlı zaman noktalarında, kısa ömürlü transkript için kullanılır. Daha sonra, mRNA'nın çürüme ya da Kuzey benek analizi, kantitatif PCR ya da RNAseq ile izlenir.
Bir te kullanarak mRNA yarı ömürleri ÖlçümüRNA polimeraz II mperature duyarlı allel avantajları vardır. Öncelikle, bu teknik yalındır kolay ve. İkinci olarak, maya cinsi, mRNA, yarı ömrü ölçümleri değişik büyüme koşulları belirlenebilir laboratuarda elde edilen veya oluşturulan bir kez; mRNA çürüme çevre etkisinin belirlenmesi sağlayan. Üçüncü olarak, mRNA, bozunma oranları genom izlenebilir. Diğer transkripsiyon önleme tekniklerinin kullanımı da avantajları ve sınırlamaları vardır. Örneğin, bir uyarılabilir promoterin kullanılması düzenlenmiş bir arttırıcının kontrolü altında olan bir mRNA üretmek üzere subklonlama gerektirir. Thiolutin hazır değil ve zaman pahalı kullanılabilir. Ayrıca, eylem thiolutin en modu tam olarak anlaşılamamış ve mRNA çürüme 7 inhibe dahil olmak üzere diğer hücresel süreçleri etkilediği bildirilmiştir. Seçenek olarak ise, 1,10-fenantrolin, daha kolaylıkla temin edilebilir. Bundan başka, tüm teknikler pert olabilir transkripsiyonunu inhibe etmek için kullanılırHücresel fonksiyonu URB ve farklı şekillerde farklı mRNA'ları etkileyebilir. Bir araştırmacı, en güvenilir sonuçlar elde etmek için deneysel koşullarda kullanmak için en uygun yöntemi belirlemek gerekiyor. Uygulama için en uygun olan yöntem belirlemek için, bir araştırmacı araştırılmaktadır transkript tarafından kodlanan proteinlerin transkript ve işlevini tanımlamak gerekiyor. en güvenilir mRNA çürüme oranı ölçümleri birden teknikler kullanılarak ve aynı çürüme oranı gösteriyor belirlenir olanlardır. Tek bir tekniktir her zaman en iyi ve en uygun tekniği özel duruma bağlıdır.
S. sayısız çalışma cerevisiae çeşitli koşullarda ve genetik geçmişleri mRNA çürüme oranları ölçüldü. mRNA çürüme oranları ölçülür olduğu koşulların belirli deney araştırılıyor bağlıdır. Koşullar olmanın olsun farklı hücresel ortamlarda mRNA bozulma oranlarını Ölçme belirlertercihen özel mRNA bozulma oranlarını etkileyen incelenir. mRNA çürüme oranları da kullanılan maya suşu bağlı olarak değişebilir. Örneğin mRNA, bozunma oranları işlevsiz bir saçma kaynaklı mRNA azalma (NMD) yolu ile yabani tip maya hücreleri ve maya hücreleri belirlenebilir. Bu mRNA bozulması yolu şimdiye kadar incelenmiş tüm ökaryot organizmalarda bulunan ve erken çeviri 8 sonlandırmak mRNAların bozulmasını tetikler. NMD başlangıçta erken sonlandırma edilen ya da anlamsız kodonlanyla mRNA'ları düşürür bir yol olarak tespit edilmiştir, ama şimdi de doğal mRNA'ları içermeyen saçmalık ifadesini düzenleyen bir yol olarak kabul edilmektedir. yolunun hedefleri mRNA'lar hızla fonksiyonel NMD yolu ile maya hücrelerinde parçalanır ve fonksiyonel olmayan NMD yolu ile maya hücrelerinde stabilize edilir. Bu nedenle, bu yolağın doğrudan hedefleri olan mRNA yarı-ömürleri, yabani tip maya cel daha kısadır veBir fonksiyonel olmayan NMD yolu ile, maya hücreleri ile karşılaştırıldığında mi.
Protocol
Representative Results
Discussion
MRNA sentezinin ve yeni sentez yokluğunda mRNA değişmesi takip durdurulması sıklıkla mRNA bozulma oranını ölçmek için kullanılan bir yöntemdir. S. cerevisiae RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile transkripsiyonunu inhibe mRNA bozunma oranları ölçümü en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Bu yöntem, özellikle, RNA polimeraz II inhibe eder. Bu tekniği kullanarak, mRNA bozulma oranlarının belirlenmesi için en kritik adımlar şunlardır: 1) maya hücreleri hasat önce, bu tr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
Referências
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
