Misura di mRNA Decay Prezzi in<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Utilizzo<em> Rpb1-1</em> Ceppi
Summary
Il livello di stato stazionario di specifici mRNA è determinata dalla velocità di sintesi e decadimento del mRNA. Velocità di degradazione mRNA genome-wide o dei tassi di decadimento di specifici mRNA può essere misurata determinando emivita mRNA. Questo protocollo si concentra sulla misurazione del mRNA tassi di decadimento in Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
mRNA livelli allo steady variano a seconda delle condizioni ambientali. Regolamento delle costanti livelli di accumulo stato di un mRNA che assicura la corretta quantità di proteine è sintetizzata per le condizioni di crescita specifici della cellula. Un approccio per misurare i tassi di decadimento mRNA è inibire la trascrizione e successivamente monitorare la scomparsa del già presente mRNA. La velocità di degradazione dell'mRNA può essere quantificato, e un accurato emivita può essere determinata utilizzando diverse tecniche. In S. cerevisiae, protocolli che misurano mRNA sono stati sviluppati emivita includono inibendo la trascrizione di mRNA utilizzando ceppi che ospitano un allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II, rpb1-1. Altre tecniche per mRNA emivite includono l'inibizione della trascrizione con inibitori trascrizionali come thiolutin o 1,10-fenantrolina, oppure misurando, utilizzando mRNA che sono sotto il controllo di un promotore regulatablecome il galattosio promotore inducibile e il sistema TET-off. Qui, descriviamo la misurazione di S. cerevisiae mRNA tassi di decadimento con l'allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II. Questa tecnica può essere usata per misurare mRNA tassi di decadimento di singoli mRNA o di tutto il genoma.
Introduction
La trascrizione e il decadimento di mRNA specifici sono determinanti cruciali della espressione genica. La velocità di sintesi e decadimento di specifici mRNA determina il livello di stato stazionario di quel particolare mRNA. I livelli di stato stazionario di mRNA governano l'abbondanza di mRNA e di determinare quanto di ogni mRNA è disponibile per la sintesi proteica. Misure di emivita di mRNA sono ampiamente utilizzati per determinare il tasso di decadimento di mRNA. MRNA specifico decadimento a tassi diversi che sono legati alle caratteristiche del mRNA, la funzione della proteina codificata dal mRNA e delle condizioni ambientali. A seconda della tecnica utilizzata per determinare i tassi di decadimento mRNA, le misurazioni del tasso di decadimento possono essere determinati a livello globale o per i singoli trascrizioni. In lievito S. cerevisiae, le tecniche che sono più comunemente usati per misurare i tassi di decadimento mRNA globale includono utilizzando un ceppo di lievito ospitare l'allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II e transc chimicainibitori riptional come thiolutin e 1,10-fenantrolina 1-5. Questi metodi possono anche essere utilizzati per misurare mRNA individuale decay rates 4. Altri metodi possono anche essere utilizzati per misurare i tassi di decadimento mRNA. Questi metodi includono approccio alla etichettatura stato stazionario o l'utilizzo di molecole di mRNA che vengono espresse da un promotore regolamentato che si esprime solo in alcune condizioni. Ognuna di queste tecniche presenta alcuni vantaggi e limitazioni. La tecnica qui descritta utilizza l'allele termosensibile di RNA polimerasi II. Questo metodo utilizza S. cerevisiae come il modello, ma può modificato e utilizzato in altri sistemi utilizzando apposite tecniche di inibizione trascrizionale 6.
mRNA misure emivita utilizzando l'allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II sono ampiamente utilizzati per entrambe le misure genome-wide e individuali di mRNA decadimento 4-5. Questa tecnica richiede l'uso di un speciflievito ic che ospita un allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II, rpb1-1 1. Il razionale di questa tecnica è che l'esposizione del ceppo di lievito termosensibile alla temperatura nonpermissive inibisce la sintesi di mRNA. Successivamente, il decadimento del mRNA preesistente viene monitorato in diversi momenti dopo la trascrizione è stato inibito. La scomparsa del mRNA preesistente è monitorato estraendo RNA dalle cellule di lievito a tempi diversi dopo la trascrizione è stata spenta. I punti di tempo in cui le cellule di lievito vengono raccolte sono predeterminati da un esperimento pilota, e dipendono dalle trascrizioni e il sistema in fase di studio. Punti di tempo più rapidi sono utilizzati per le trascrizioni di breve durata, mentre i punti di tempo più lunghi sono utilizzati per le trascrizioni lungo vissuto. Successivamente, il decadimento del mRNA è monitorato da una analisi Northern blot, PCR quantitativa o RNAseq.
Misura di emivita di mRNA utilizzando un temperature allele sensibile di RNA polimerasi II ha i suoi vantaggi. In primo luogo, questa tecnica è facile e semplice. In secondo luogo, una volta che il ceppo di lievito è acquisito o generato in laboratorio gli mRNA misure mezza vita possono essere determinati in diverse condizioni di crescita; consentire la ricostruzione della influenza ambientale sul mRNA decadimento. In terzo luogo, i tassi di decadimento mRNA possono essere monitorati a livello di genoma. L'utilizzo di altre tecniche di inibizione della trascrizione ha anche vantaggi e limiti. Ad esempio, l'uso di un promotore inducibile richiede subcloning per generare un mRNA che è sotto il controllo del promotore regolato. Thiolutin non è prontamente disponibile ed è costoso quando disponibile. Inoltre, la modalità di thiolutin di azione non è completamente noto ed è stato segnalato per influire su altri processi cellulari, tra cui l'inibizione mRNA decadimento 7. In alternativa, 1,10-fenantrolina, è più facilmente disponibile. Inoltre, tutte le tecniche utilizzate per inibire la trascrizione può Perturb funzione cellulare e può colpire diversi mRNA in modi diversi. Un investigatore deve determinare il metodo più appropriato da utilizzare nelle loro condizioni sperimentali per ottenere i risultati più affidabili. Per determinare qual è il metodo più adatto per la loro applicazione, un ricercatore ha bisogno di identificare le trascrizioni e la funzione delle proteine codificate dai trascrizioni di essere indagati. Le misurazioni dei tassi di mRNA decadimento più affidabili sono quelli che sono determinato usando diverse tecniche e mostrare lo stesso tasso di decadimento. Nessuna singola tecnica è sempre la migliore, e la tecnica più appropriata dipende dalla situazione specifica.
Numerosi studi in S. cerevisiae hanno misurato i tassi di decadimento mRNA in varie condizioni e background genetico. Le condizioni che i tassi di decadimento mRNA sono misurati in dipendono dalla esperimento specifico oggetto di indagine. Misurare i tassi di decadimento mRNA in differenti ambienti cellulari determina se le condizioni di essereesaminati preferenzialmente influenzare i tassi di decadimento di mRNA specifici. I tassi di decadimento di mRNA può anche variare a seconda del ceppo di lievito utilizzato. Ad esempio, i tassi di decadimento mRNA possono essere determinati in cellule di lievito wild-type e le cellule di lievito con un nonsense-mediata mRNA degradazione (NMD) percorso non funzionali. Questo degrado percorso mRNA si trova in tutti gli organismi eucarioti che sono stati esaminati finora e si innesca la degradazione di mRNA che terminano prematuramente traduzione 8. NMD è stato inizialmente identificato come un percorso che degrada mRNA con codoni di terminazione prematuri o codoni nonsenso, ma è ormai riconosciuto come un percorso che regola anche l'espressione di non-nonsense contenente mRNA naturali. mRNA che sono gli obiettivi del percorso sono rapidamente degradati in cellule di lievito con un percorso NMD funzionale e stabilizzato in cellule di lievito con un percorso NMD non funzionale. Così, l'emivita di mRNA che sono obiettivi diretti di questa via sono più brevi in wild-type lievito cells rispetto alle cellule di lievito con un percorso NMD non funzionali.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'inibizione della sintesi di mRNA e monitoraggio fatturato mRNA in assenza di nuova sintesi è un metodo che viene spesso utilizzato per misurare i tassi di decadimento mRNA. In S. cerevisiae, la misurazione dei tassi mRNA decadimento inibendo la trascrizione usando l'allele termosensibile di RNA polimerasi II è uno dei metodi più usati. Questo metodo inibisce specificamente l'RNA polimerasi II. Le fasi più critiche per la determinazione dei tassi di decadimento mRNA con questa tecnica sono: 1) …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
Referências
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