Flowcytometrisystemer protokoller for Surface og Intracellulær Antigen Analyser av Neural celletyper

Summary

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Abstract

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

Introduction

Flowcytometri har blitt grundig utnyttet i immunologi, hematologi og onkologi å definere celle populasjoner via iboende scatter egenskaper, celleoverflateantigen uttrykk og andre fluorescens parametre ^1-3. Våre innsikt i blod avstamning utvikling og sykdom er et resultat av en betydelig grad av den kontinuerlige forbedringer av denne metoden etter dens første ^4,5 gjennomføringen. Økt bevissthet om kvantitative og generell analytisk potensial flowcytometri har nylig oppfordret sine mer utbredt bruk i stamcelleforskning, og kan gjøre det mulig tilsvar dyp fremgang i en kortere tidsramme ^6. Imidlertid har anvendelsen av flowcytometri for spesifikt å analysere og isolere nervepopulasjoner lenge vært oppfattet som utfordrende. I motsetning til hematopoetiske celler som naturlig finnes i suspensjonen, er neurale celletyper vanligvis høstet fra overdrevent komplekse kilder som kan innbefatte gliaceller og diverse other omliggende celler samt et intrikat nettverk av prosessbærende nevroner. Derfor har nevrobiologi ennå å implementere allsidigheten flowcytometri til sin fullstendige potensialet i daglige forsknings rutiner. Imidlertid, så lenge som en levedyktig, enkel cellesuspensjon kan genereres (og protokoller er utviklet og optimalisert for det formålet ^7), flowcytometri og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) kan betraktes som en verdifull del av analyse repertoar i neurobiology ^8-11.

. Figur 1. Prinsipp for flowcytometrisk analyse og komponenter av et flowcytometer flowcytometere består av tre hovedsystemer: fluidics, optikk og elektronikk. En strømlinjeformet strøm av celler i suspensjon (fremstilt fra primært eller vev in vitro kultur) oppnås ved kappen fluid via hydrodynamisk fokusering, begrenser prøven til dets midtkjernen. De optiske deler er sammensatt av lasere som belyser strømmen av celler og optiske filtre som styrer signalet til de passende detektorer. Lyssignalene oppdaget konverteres til elektroniske signaler, deretter behandles av en datamaskin og visualisert på en monitor for dataanalyse og gating. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Brukere av strømningscytometriske metoder overskudd fra minst en grunnleggende forståelse av de underliggende fundamentale forhold, inkludert en cytometer byggesteiner (for oversikt se ^12,13, se også figur 1). En laserstråle skjærer med en hydrodynamisk fokusert fluidstrømmen som inneholder de celler i suspensjonen, som i sin tur passerer gjennom laserstrålen i 'enkelt fil' etter hverandre. Den interceptipå i en celle (eller enhver annen partikkel, for den saks skyld) med laser resulterer i spredning av lyset fra denne utspørringspunktet. Spredt lys kan detekteres i fortsettelse av laserretningen (forover spredning, forbundet med størrelsen av partikkelen), samt vinkelrett på retningen (side scatter; reflekterer granulosity av partikkel / celle). Disse nevnte spredningsegenskaper ikke krever spesiell merking, noe som er grunnen til at en umerket prøve (eller også mobilnettet rusk, luftbobler, etc.) vil generere et signal (hendelse) på bivariate fremover scatter versus side spredningsdiagram som vanligvis brukes til innledende gating. Ved å bruke de passende lasere og filtre som er spesifikke for den tilhørende eksitasjon og emisjonsspektra, kan en celle bli analysert for sin positivitet, nivå av intensitet eller fravær av fluorescerende markører. Flertallet av strømningscytometriske applikasjoner har fokusert på karakterisering via celleoverflateantigener. I motsetning til blodkreft lineage har nevrale avstamning forble mindre omfattende definert i henhold til overflaten epitope uttrykk mønstre ^fem. En fordel med å utnytte overflateantigener er at levende celler kan utsettes for cellesortering paradigmer som FACS. I kontrast, krever intracellulær antigen flekker fiksering og permeabilization skritt for å mekle epitopet-antistoff samhandling, utelukker nedstrøms applikasjoner som krever levedyktige celler. Av notatet, slike tilnærminger fortsatt tillate for mange kvantitative analyser ¹⁴ samt nedstrøms analyser for RNA og protein uttrykk ^15. Hematologi, immunologi og onkologi har ofte brukt mer enn et dusin markører i forbindelse å definere bestemte subpopulasjoner ^16. Dessuten kan massen cytometri eller CyTOF nå bli brukt til å analysere opptil 30 parametere samtidig, ^17,18.

For nevrale stamcelle applikasjoner samt primærkulturer ^14,19,20 den heterogenitet av celler ivitro er et vanlig fenomen ^21-23. Cellene ikke representerer målgruppen av interesse legemliggjøre et potensielt problemfaktor for eksperimentell avlesning ^24,25. Hensiktsmessig de forskjellige cellulære undersett som er tilstede i en heterogen cellesuspensjon bærer distinkte (som er kjent eller som vil bli tydet) antigen ekspresjon profiler, som kan benyttes for å definere disse forskjellige populasjonene. Flowcytometri kan dermed spille en avgjørende rolle i å løse cellulære heterogenitet og dermed legge til rette for biomedisinske applikasjoner (in vitro, celleterapi) og optimalisere kvantitativ avlesning ved å fokusere på den mest relevante undergruppe ^24,26. Forskjellige overflate antigen kombinasjoner er blitt identifisert i løpet av de siste årene for å tillate kvantitering og isolering av bestemte neurale celletyper. Dette omfatter CD133 for anriking av nevrale stamceller ^27, slik at kombinasjonen av de CD15 / CD24 / CD29-overflateantigener for isolering av NSC, differentiated nevron og neural crest celler ²⁸ eller CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 å isolere nevrale og gliaceller undergrupper ^25, blant andre signaturer ^29,30. Utover nevroner, gliaceller markører A2B5 ^31, CD44 ^25, NG2 ³² og GLAST ^33. En fersk publikasjon har utnyttet den midthjernen gulv forløper markør CORIN ^34,35 å berike for dopaminerge forløpere i Parkinson celletransplantasjon paradigmer ^36. CD-molekyler er ikke bare markører, men funksjonelt relevante mediatorer av celle-celle interaksjoner og i en celle evne til å svare på signaler fra ekstracellulære matrise molekyler og vekstfaktorer ^37. En strategi for ytterligere styrking av arsenal av kombinatoriske CD antigener å karakter nevrale avstamning utvikling er å bruke kjente intracellulære markører for å screene for og definere CD antigen kombinasjoner for en bestemt celletype av interesse. Vi har nylig utnyttes slik tilnærming og identifisert CD49f ^– / CD200 ^høye kombinatoriske uttrykk mønstre som en ny tilnærming for berikende nevronale undergrupper fra nevralt differensierte indusert pluripotente stamceller kultursystemer ^38. Her inkluderer vi diskutere og den sistnevnte protokoll (og eventuelle variasjoner derav), hvor overflatefarging og intracellulær farging kan brukes samtidig for å definere nervecellepopulasjoner ved strømningscytometri.

Figur 2 viser et flytdiagram av eksperimentelle protokoll alternativer. Figuren viser en skjematisk fremstilling av de viktigste trinnene involvert i protokollen. Valgfritt trinn (CFSE dye eller intracellulær antigen merking) er angitt med lys grå ruter. Etter høsting, er det viktig å vurdere levedyktigheten og celleantallet av nervecellesuspensjoner før celleoverflatefarging. Positiv somvel som negative kontroller trenger å være inkludert i tillegg til prøvene av interesse. Prøvene kan analyseres ved flowcytometrisk analyse og / eller brukes i celle sortering paradigmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mens vi tidligere har brukt primært antistoff i kombinasjon med sekundært antistoff for intracellulær farging ^38, introduserer vi nå ikke-kovalent merking av det primære antistoff via fluorescerende Fab-fragmenter (Zenon merking) som en svak variant, for derved å redusere de trinn celle ³⁹ manipulasjon. Videre, som et ytterligere eksempel på protokoll allsidighet, anvender vi en eventuell merking av en eksperimentell undergruppe av karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE) før overflateantigen farging. Slike CFSE pre-merking muliggjør umiddelbar direkte sammenligning av to cellelinjer eller eksperimentelle betingelser (CFSE-merket vs. umerket) i et enkelt prøverør, redusere avviket eller små forskjeller i inkubasjonstid og lagring av antistoff. CFSE er en etablert fluorescerende fargestoff som vanligvis brukes for celle sporing ^40, i sprednings ^41,42 og strekkoding eksperimenter ^43,44. Til slutt, mens selve sorterings trinn (FACS, immunomagnetisk Celleseparasjonsanordningene eller immunopanning) er ikke en del av denne protokollen, i prinsippet, slakteriene og merking prosedyrene som er beskrevet her gjør avkastning prøver som kan utsettes til overflaten antigen eller intracellulære merking basert sortering applikasjoner ^{15 25,28.}

Med denne artikkelen, vi tar sikte på å: oppsummere en levedyktig overflateantigen farging protokollen ^25,28, oppsummere en protokoll for påvisning av intracellulære mål samt kombinert overflate og intracellulær antigen analyse ^38, presentere en intracellulær CFSE fargestoff merking steg ^41,45 som en eksperimentell alternativ for comkomparative analyser av nervecellepopulasjoner, og oppsummere tilnærminger til flowcytometri analyse (hensiktsmessige kontroller ^13,46, gating strategi og datapresentasjon ^47).

Protocol

1. Neural Cell Høsting Vurderingen av mikroskop: Før oppstart av et eksperiment, sjekke status på kulturen med lyse-feltet eller fasekontrastmikroskopi. MERK: Mens primære nevrale vev hentet fra disseksjoner er i prinsippet like mottagelig for flowcytometrisk analyse 14,28, vær oppmerksom på at protokollen fokus er på celler hentet fra in vitro nevrale cellesystemer. Høsting celler 7: Forsiktig vaske fatet / kolbe av adherente…

Representative Results

Protokollen presenteres her gir mulighet for allsidig eksperimentelle tilnærminger (figur 2). I sin korteste versjonen (trinn 1, 3 og 6), kan det betraktes som en guide for enkel farging av overflateantigener. I sin mer kompleks form, kan en rekke co-merking paradigmer med en rekke intracellulære antigener bli forfulgt (valgfritt trinn 2 og / eller 4 til 5). Videre eksemplifiserer CFSE-merking trinn sin nytteverdi for…

Discussion

Protokollen som presenteres her er vel etablert for neural cellekulturer avledet fra humane stamceller, men kan like anvendes på andre neurale cellekilder, inkludert primære neural vev eller cellelinjer. I tillegg til embryonale kilder, kan neurale stamceller og forløperceller ekstraheres fra den nevrogene regioner av voksen hjerne ^27. Videre flow cytometri og FACS kan utnyttes til å kvantifisere, analysere og isolere forskjellige cellepopulasjoner, inkludert moden nerveceller ^{54, 33,} astroglia…

Materials

DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Life Technologies	11330057	www.lifetechnologies.com
DPBS without Ca2+ Mg2+	Life Technologies	14190169	www.lifetechnologies.com
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)	Life Technologies	10270-106	www.lifetechnologies.com
MEM Non-essential amino acids (100 x)	Life Technologies	11140035	www.lifetechnologies.com
TrypLE Express	Life Technologies	12604013	www.lifetechnologies.com
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250061	www.lifetechnologies.com
Paraformaldehyde	Carl Roth	335.3	www.carlroth.com
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	PAA Laboratories, Coelbe	K41-001	www.gelifesciences.com
Tween-20 Detergent	Calbiochem	655205	www.merckmillipore.de
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	eBioscience	65-0850-84	www.ebioscience.com
DMSO	AppliChem	A1584	www.applichem.com
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml	Millipore	SCGPU02RE	www.millipore.com
Cell culture treated flasks (T 25)	NUNC	156367	www.thermoscientific.com
Cell culture treated flasks (T 75)	NUNC	156499	www.thermoscientific.com
Conical tubes (15 ml)	Greiner Bio-One	188271	www.greinerbioone.com
Conical tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227261	www.greinerbioone.com
Pasteur pipet, glass (150 mm)	STEIN Labortechnik, Remchingen	S03710150	www.stein-labortechnik.de
Pipet tips (0.1-10 µl)	Corning	4125	www.corning.com
Pipet tips (1-200 µl)	Corning	4126	www.corning.com
Pipet tips (100-1000 µl)	Corning	4129	www.corning.com
Serological pipets, 5 ml	Corning	4051	www.corning.com
Serological pipets, 10 ml	Corning	4101	www.corning.com
Serological pipets, 25 ml	Corning	4251	www.corning.com
Microcentrifuge tubes (0.5 ml)	Sarstedt	72,699	www.sarstedt.com
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Greiner Bio-One	616201	www.greinerbioone.com
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)	Sarstedt	72,695,500	www.sarstedt.com
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody	eBioscience	17-0247-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody	eBioscience	12-0549-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody	Covance	PRB-435P	www.covance.com Working dilution 1:2000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit	Life Technologies	A21206	www.lifetechnologies.com Working dilution 1:2000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit	Life Technologies	Z-25342	www.lifetechnologies.com
Neubauer-Improved counting chamber	Marienfeld	0640010	www.marienfeld-superior.com
Vortex	Scientific Industries	G560E	www.scientificindustries.com
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.001	www.eppendorf.com
Accuri C6 flow cytometer	Becton Dickinson (BD)	653118	www.bdbiosciences.com/instruments/accuri
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R	Peqlab	91-PSPIN-24R	www.peqlab.de
Orbital shaker, Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00	www.heidolph-instruments.de
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC	Hettich	4480-50	www.hettichlab.com
Class II Biological safety cabinet Safe 2020	Thermo Scientific	51026640	www.thermoscientific.com
CO2 Incubator, Heracell 240i	Thermo Scientific	51026331	www.thermoscientific.com
Vacuum system, Vacusafe comfort	Integra Biosciences	158320	www.integra-biosciences.de
Microscope, Axiovert 40 CFL	Zeiss	451212	www.zeiss.de
Pipet controller, accu-jet pro	Brand	26303	www.brand.de
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl)	Gilson	F144563	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl)	Gilson	F144565	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl)	Gilson	F144566	www.gilson.com