Citometría de Flujo Protocolos de superficie y intracelular de antígenos Los análisis de los tipos de células neuronales

Summary

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Abstract

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

Introduction

La citometría de flujo se ha explotado ampliamente en la inmunología, hematología y oncología para definir poblaciones de células a través de las propiedades intrínsecas de dispersión, antígeno de superficie de la célula de expresión, y otros parámetros de fluorescencia ^1-3. Nuestros conocimientos sobre el desarrollo linaje de sangre y la enfermedad son el resultado de un grado significativo de el refinamiento continuo de esta metodología después de su aplicación inicial de ^4,5. Una mayor conciencia del potencial analítico cuantitativo y global de citometría de flujo ha animado recientemente su uso más generalizado en la investigación con células madre y puede permitir igualmente profunda progreso en un marco de tiempo más corto ^6. Sin embargo, la aplicación de citometría de flujo para analizar específicamente y aislar poblaciones neuronales durante mucho tiempo ha sido percibido como un reto. En contraste con las células hematopoyéticas que existen naturalmente en suspensión, tipos de células neuronales se cosechan típicamente de fuentes excesivamente complejos que pueden incluir células gliales y varios other células circundantes, así como una intrincada red de neuronas de procesos que soportan. En consecuencia, la neurobiología todavía tiene que aplicar la versatilidad de citometría de flujo a su potencial completo en las rutinas diarias de investigación. Sin embargo, siempre y cuando una suspensión de una sola célula viable puede ser generado (y protocolos se han ideado y optimizado para este fin ^7), citometría de flujo y células activadas por fluorescencia (FACS) puede ser considerado como un valioso elemento del repertorio analítico en neurobiología ^8-11.

. Figura 1. Principio de análisis de citometría de flujo y componentes de un citómetro de flujo flujo citómetros comprenden tres sistemas principales: hidráulica, óptica y electrónica. Un flujo aerodinámico de células en suspensión (preparado a partir de tejido primario o pt cultivo in vitro) se lleva a cabo por el FLUI vainad través enfoque hidrodinámico, restringiendo la muestra a su núcleo central. Las partes ópticas se componen de láseres que iluminan la corriente de células y filtros ópticos que dirigen la señal a los detectores apropiados. Las señales de luz detectadas se convierten en señales electrónicas, posteriormente procesadas por una computadora y visualizados en un monitor para el análisis de datos y conmutación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los usuarios de los métodos de citometría de flujo de ganancias de al menos un conocimiento básico de los fundamentos subyacentes, como bloques de construcción de un citómetro (para revisión ver ^12,13; también ver Figura 1). Un rayo láser se cruza con una corriente de fluido hidrodinámicamente enfocada que contiene las células en suspensión, que a su vez pasan a través del haz de láser en 'solo archivo' uno tras otro. El interceptien de una célula (o cualquier otra partícula, para el caso) con los resultados de láser en la dispersión de la luz desde este punto de interrogación. La luz dispersada se puede detectar en la continuación de la dirección láser (dispersión hacia adelante, asociado con el tamaño de la partícula), así como perpendicular a su dirección (dispersión lateral; reflejando la granulosidad de la partícula / célula). Estas propiedades de dispersión antes mencionados no requieren etiquetado específico, por lo que una muestra sin etiqueta (o también restos celulares, burbujas de aire, etc.) generará una señal (evento) en la dispersión hacia adelante frente bivariado lado gráfico de dispersión comúnmente utilizado para gating inicial. Mediante el uso de los láseres y filtros específicos para el correspondiente espectros de excitación y emisión adecuadas, una célula puede ser analizada por su positividad, el nivel de intensidad, o ausencia de marcadores fluorescentes. La mayoría de las aplicaciones de citometría de flujo se han centrado en la caracterización a través de antígenos de superficie celular. A diferencia de la lineag hematopoyéticoe, el linaje neural ha permanecido menos ampliamente definida de acuerdo con los patrones de expresión de superficie epítopo ^5. Una ventaja de la explotación de los antígenos de superficie es que las células vivas pueden ser sometidos a la celda paradigmas de clasificación, tales como FACS. En contraste, la tinción de antígeno intracelular requiere etapas de fijación y permeabilización de mediar en la interacción-epítopo de anticuerpo, lo que impide aplicaciones posteriores que requieren células viables. De nota, estos enfoques aún permiten para numerosos ensayos cuantitativos ^14, así como los análisis aguas abajo para ARN y expresión de la proteína ^15. Hematología, inmunología y oncología han utilizado a menudo más de una docena de marcadores en conjunto para definir determinadas subpoblaciones ^16. Además, la citometría de masa o CyTOF ahora se pueden utilizar para analizar hasta 30 parámetros simultáneamente ^17,18.

Para aplicaciones de células madre neurales, así como cultivos primarios ^14,19,20 la heterogeneidad de las células ptvitro es un fenómeno común ^21-23. Las células no representan a la población diana de interés encarnan un factor potencialmente de confusión para la lectura experimental ^24,25. Convenientemente, los diferentes subconjuntos celulares presentes dentro de una suspensión de células heterogénea tienen perfiles de expresión de antígeno diferentes (conocidas o aún para ser descifrados), que pueden ser utilizados para definir estos diferentes poblaciones. La citometría de flujo por lo tanto puede desempeñar un papel crucial en la resolución de la heterogeneidad celular y, de ese modo, facilitar aplicaciones biomédicas (ensayos in vitro, la terapia celular) y optimizar lectura cuantitativa, centrándose en el subconjunto más relevantes ^24,26. Varias combinaciones del antígeno de superficie han sido identificados en los últimos años para permitir la cuantificación y el aislamiento de tipos específicos de células neuronales. Esto incluye CD133 para el enriquecimiento de células madre neurales ^27, una combinación de los CD15 / CD24 / CD29 antígenos de superficie para el aislamiento de NSC, Differentiated neuronas y las células de la cresta neural ²⁸ o CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 para aislar los nervios y subconjuntos gliales ^25, entre otras firmas ^29,30. Más allá de las neuronas, marcadores gliales incluyen A2B5 ^31, CD44 ^25, NG2 ³² y GLAST ^33. Una publicación reciente ha explotado el cerebro medio marcador precursor floorplate CORIN ^34,35 para enriquecer precursores dopaminérgicos en el trasplante de células Parkinson paradigmas ^36. Moléculas de CD no son únicos marcadores, pero funcionalmente relevantes mediadores de las interacciones célula-célula y de la capacidad de una célula para responder a las señales de las moléculas de la matriz extracelular y factores de crecimiento ^37. Una estrategia de mejorar aún más el arsenal de antígenos CD combinatorias para caracterizar el desarrollo del linaje neural es el uso de marcadores intracelulares conocidos para detectar y definir combinaciones de antígenos CD para un tipo de célula particular de interés. Hemos explotado recientemente un enfoque de este tipo e identificado CD49f ^– / CD200 ^altos patrones de expresión combinatoria como un enfoque novedoso para enriquecer subconjuntos neuronales a partir de sistemas de cultivo de células madre pluripotentes inducidas neuralmente diferenciados ^38. Aquí, incluimos y discutimos este último protocolo (y variaciones opcionales de los mismos) en los que tinción de la superficie y la tinción intracelular se pueden utilizar simultáneamente para definir subpoblaciones de células neuronales por citometría de flujo.

Figura 2. Diagrama de flujo de opciones de protocolo experimental. La figura representa una representación esquemática de las principales etapas implicadas en el protocolo. Pasos opcionales (tinte CFSE o etiquetado antígeno intracelular) se indican con cajas de color gris claro. Después de la cosecha, es esencial para evaluar la viabilidad celular y número de suspensiones de células neurales antes de la tinción de la superficie celular. Positivo comoasí como controles negativos se deben incluir además de las muestras de interés. Las muestras pueden ser analizadas mediante análisis de citometría de flujo y / o se utilizan en los paradigmas de clasificación de células. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Si bien hemos utilizado anteriormente anticuerpo primario en combinación con el anticuerpo secundario para la tinción intracelular ^38, introducimos ahora etiquetado no covalente del anticuerpo primario a través de fragmentos Fab fluorescentes (etiquetado Zenon) como una ligera variación, reduciendo así las etapas de la manipulación de células ^39. Por otra parte, como un ejemplo más de la versatilidad del protocolo, empleamos un etiquetado facultativo de un subconjunto experimental por carboxifluoresceına succinimidiléster (CFSE) antes de salir a la superficie tinción antígeno. Tal pre-etiquetado CFSE permite la comparación inmediata directa de dos líneas celulares o condiciones experimentales (CFSE marcado vs. sin etiqueta) dentro de un único tubo de muestra, la reducción de la varianza o sutiles diferencias en el tiempo de incubación y el ahorro de anticuerpo. CFSE es un colorante fluorescente establecido que se utiliza comúnmente para el seguimiento de la célula ^40, en la proliferación de ^41,42 y ^43,44 códigos de barras experimentos. Por último, mientras que los pasos reales (FACS, separación celular inmunomagnética o immunopanning) no forman parte de este protocolo, en principio, la recolección y el etiquetado que se describen aquí hacen muestras de rendimiento que se pueden someter a la superficie de antígeno o aplicaciones intracelulares basado etiquetado clasificación ^{15 25,28.}

Con este artículo, nos proponemos: resumir una superficie viable protocolo de tinción antígeno ^25,28, resumir un protocolo para la detección de dianas intracelulares, así como la superficie combinada y el análisis del antígeno intracelular ^{de 38 años,} presentar un paso CFSE etiquetado tinte intracelular ^41,45 como opción experimental para comcomparativa análisis de poblaciones de células neuronales, y resumir los enfoques para el análisis de citometría de flujo (controles apropiados ^13,46, apertura de puerta estrategia y datos de presentación ^47).

Protocol

1. Neural cosecha celular Evaluación por microscopio: Antes de iniciar un experimento, comprobar el estado de la cultura con la de campo claro o microscopía de contraste de fase. NOTA: Mientras que el tejido neural primaria obtenida de disecciones es, en principio, igualmente susceptibles de análisis de citometría de flujo 14,28, por favor, tenga en cuenta que el enfoque del protocolo está en las células obtenidas de los sistemas de células neurales in vitro. </…

Representative Results

El protocolo que aquí se presenta permite enfoques versátil experimentales (Figura 2). En su versión más corta (pasos 1, 3 y 6), que puede considerarse una guía para la tinción simple de los antígenos de superficie. En su forma más compleja, una serie de paradigmas co-etiquetado con una gama de antígenos intracelulares puede ser perseguido (pasos opcionales 2 y / o 4 a 5). Por otra parte, el pa…

Discussion

El protocolo presentado aquí está bien establecido para los cultivos de células neurales derivadas de células madre humanas, pero se puede aplicar igualmente a otras fuentes de células neuronales incluyendo tejido primario o líneas celulares neuronales. Además de las fuentes embrionarias, las células madre o progenitoras neurales pueden ser extraídos de las regiones neurogénicas de cerebro adulto de ^27. Además, la citometría de flujo FACS y se pueden explotar para cuantificar, analizar y aislar di…

Materials

DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Life Technologies	11330057	www.lifetechnologies.com
DPBS without Ca2+ Mg2+	Life Technologies	14190169	www.lifetechnologies.com
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)	Life Technologies	10270-106	www.lifetechnologies.com
MEM Non-essential amino acids (100 x)	Life Technologies	11140035	www.lifetechnologies.com
TrypLE Express	Life Technologies	12604013	www.lifetechnologies.com
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250061	www.lifetechnologies.com
Paraformaldehyde	Carl Roth	335.3	www.carlroth.com
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	PAA Laboratories, Coelbe	K41-001	www.gelifesciences.com
Tween-20 Detergent	Calbiochem	655205	www.merckmillipore.de
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	eBioscience	65-0850-84	www.ebioscience.com
DMSO	AppliChem	A1584	www.applichem.com
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml	Millipore	SCGPU02RE	www.millipore.com
Cell culture treated flasks (T 25)	NUNC	156367	www.thermoscientific.com
Cell culture treated flasks (T 75)	NUNC	156499	www.thermoscientific.com
Conical tubes (15 ml)	Greiner Bio-One	188271	www.greinerbioone.com
Conical tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227261	www.greinerbioone.com
Pasteur pipet, glass (150 mm)	STEIN Labortechnik, Remchingen	S03710150	www.stein-labortechnik.de
Pipet tips (0.1-10 µl)	Corning	4125	www.corning.com
Pipet tips (1-200 µl)	Corning	4126	www.corning.com
Pipet tips (100-1000 µl)	Corning	4129	www.corning.com
Serological pipets, 5 ml	Corning	4051	www.corning.com
Serological pipets, 10 ml	Corning	4101	www.corning.com
Serological pipets, 25 ml	Corning	4251	www.corning.com
Microcentrifuge tubes (0.5 ml)	Sarstedt	72,699	www.sarstedt.com
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Greiner Bio-One	616201	www.greinerbioone.com
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)	Sarstedt	72,695,500	www.sarstedt.com
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody	eBioscience	17-0247-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody	eBioscience	12-0549-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody	Covance	PRB-435P	www.covance.com Working dilution 1:2000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit	Life Technologies	A21206	www.lifetechnologies.com Working dilution 1:2000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit	Life Technologies	Z-25342	www.lifetechnologies.com
Neubauer-Improved counting chamber	Marienfeld	0640010	www.marienfeld-superior.com
Vortex	Scientific Industries	G560E	www.scientificindustries.com
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.001	www.eppendorf.com
Accuri C6 flow cytometer	Becton Dickinson (BD)	653118	www.bdbiosciences.com/instruments/accuri
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R	Peqlab	91-PSPIN-24R	www.peqlab.de
Orbital shaker, Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00	www.heidolph-instruments.de
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC	Hettich	4480-50	www.hettichlab.com
Class II Biological safety cabinet Safe 2020	Thermo Scientific	51026640	www.thermoscientific.com
CO2 Incubator, Heracell 240i	Thermo Scientific	51026331	www.thermoscientific.com
Vacuum system, Vacusafe comfort	Integra Biosciences	158320	www.integra-biosciences.de
Microscope, Axiovert 40 CFL	Zeiss	451212	www.zeiss.de
Pipet controller, accu-jet pro	Brand	26303	www.brand.de
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl)	Gilson	F144563	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl)	Gilson	F144565	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl)	Gilson	F144566	www.gilson.com