Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.
La conversion de la lumière en impulsions électriques se produit dans la rétine externe et est réalisée en grande partie par bâtonnets et des cônes photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des cellules. RPE fournir un soutien essentiel pour les photorécepteurs et la mort ou le dysfonctionnement des cellules RPE est caractéristique liée à l'âge dégénérescence maculaire (DMLA), la principale cause de perte de vision permanente chez les personnes de 55 ans et plus. Alors pas de remède pour AMD a été identifié, l'implantation d'un EPR sain dans les yeux malades peut se avérer un traitement efficace, et un grand nombre de cellules RPE peut être facilement généré à partir de cellules souches pluripotentes. Plusieurs questions intéressantes quant à l'innocuité et l'efficacité de la prestation des cellules RPE peuvent encore être examinés dans des modèles animaux, et des protocoles bien acceptées utilisées pour injecter RPE ont été développés. La technique décrite ici a été utilisé par plusieurs groupes dans diverses études et consiste à créer d'abord un trou dans l'œil avec une aiguille. Ensuite, une seringue avec une bluaiguille nt chargé avec des cellules est inséré à travers le trou et passe à travers le corps vitré jusqu'à ce qu'il touche le RPE. En utilisant cette méthode d'injection, ce qui est relativement simple et nécessite un minimum d'équipement, nous obtenons une intégration cohérente et efficace des cellules RPE dérivés de cellules souches dans le RPE entre hôte qui empêche la quantité importante de dégénérescence des photorécepteurs chez des modèles animaux. Bien que ne faisant pas partie du protocole proprement dit, on décrit également comment déterminer l'ampleur du traumatisme induit par l'injection, et la façon de vérifier que les cellules ont été injectées dans l'espace sous-rétinien pt utilisant des modalités d'imagerie in vivo. Enfin, l'utilisation de ce protocole ne est pas limitée aux cellules RPE; il peut être utilisé pour injecter ne importe quel composé ou d'une cellule dans l'espace sous-rétinien.
The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly1,2.
While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration16,18,21,22,25,28,29. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing30,31.
RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)34. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill16,18,21,29,36,37. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation31. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.38)
The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.
Dans cet article, nous décrivons une méthode relativement simple pour réaliser des injections sous-rétiniens de cellules RPE en suspension dans les rats et les souris. Le protocole est facile à apprendre et plus d'expérience avec la technique se traduiront par moins de traumatismes (figure 3, ce qui représente l'un des meilleurs injections), surtout si un micromanipulateur est utilisé (figure 1A). Tout traumatisme peut être contrôlée in vivo avec un système …
The authors have nothing to disclose.
We wish to thank Alison Dorsey for helping to develop the subretinal injection technique. We also acknowledge the National Eye Institute (NEI grants EY11254 and EY021416), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM grant TR1-01219), and the Lowy Medical Research Institute (LMRI) for very generous funding for this project.
Name of Material/ Equipment (A-Z) | Company | Catalog Number | Comments/Description |
2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21985-023 | 50 mL x 1 |
Cell Scapers | VWR | 89260-222 | Case x 1 |
CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C34552 | 50 ug x 20 |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | 500 mL x 1 |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | 25 g x 1 |
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops | Walmart | 4060941 | 25 mL x 1 |
Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
Hamilton Needle 33 gauge, 0.5", point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | 500 mL x 1 |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | 500 mL x 1 |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | 100 mL x 1 |
Magnetic Stand | Leica Biosystems | 39430216 | Stand x 1 |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Gibco | 11140-050 | 100 mL x 1 |
Micromanipulator | Leica Biosystems | 3943001 | Manipulator x 1 |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 100 mL x 1 |
Slip Tip Syringes without Needles BD (3 mL) | VWR | BD309656 | Pack x 1 |
Specialty-Use Needles BD (30 gauge, 1") | VWR | BD305128 | Box x 1 |
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | 100 mL x 1 |