Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

Summary

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Abstract

La conversión de la luz en impulsos eléctricos se produce en la retina externa y se lleva a cabo en gran medida por conos y bastones fotorreceptores y células del epitelio pigmentario de la retina (RPE). RPE proporcionar apoyo crítico a los fotorreceptores y la muerte o la disfunción de las células del EPR es característico de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de la pérdida permanente de la visión en personas mayores de 55 años. Si bien no hay cura para la DMAE ha sido identificado, la implantación de RPE saludable en ojos enfermos puede llegar a ser un tratamiento efectivo, y un gran número de células del EPR puede generarse fácilmente a partir de células madre pluripotentes. Varias preguntas interesantes sobre la seguridad y eficacia de la entrega de células RPE todavía pueden ser examinadas en modelos animales, y los protocolos bien aceptados utilizados para inyectar RPE se han desarrollado. La técnica descrita aquí ha sido utilizado por varios grupos en diversos estudios y consiste en crear primero un agujero en el ojo con una aguja afilada. A continuación, una jeringa con una blunt aguja cargada con células se inserta a través del agujero y pasa a través del humor vítreo hasta que toque suavemente el RPE. El uso de este método de inyección, que es relativamente simple y requiere un mínimo de equipo, logramos la integración coherente y eficaz de las células RPE derivadas de células madre en entre el RPE host que impide cantidad significativa de degeneración de los fotorreceptores en modelos animales. Aunque no es parte del protocolo real, también se describe cómo determinar la extensión de la trauma inducido por la inyección, y cómo verificar que las células fueron inyectadas en el espacio subretiniano pt el uso de técnicas de imagen in vivo. Finalmente, el uso de este protocolo no se limita a las células del RPE; puede utilizarse para inyectar cualquier compuesto o de células en el espacio subretiniano.

Introduction

The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly^1,2.

While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option^3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically^14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration^{16,18,21,22,25,28,29}. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing^30,31.

RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques^32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)³⁴. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill^{16,18,21,29,36,37}. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation³¹. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.³⁸)

The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.

Protocol

NOTA: Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las normas éticas establecidas por el Instituto de Investigación Scripps. 1. Preparación de los materiales para la inyección (~ 20 min) Solución de disociación celular Pre-caliente (preferiblemente uno que se inactiva a través de la dilución, no con suero), PBS estéril y medios de cultivo (Tabla 1). Esterilizar la jeringa con una aguja de punta roma por el desmont…

Representative Results

Podemos entregar una suspensión de células del EPR en el espacio subretiniano de roedores rápida y consistente con la técnica descrita en este manuscrito. Aunque no es necesario, traumas pueden minimizar en gran medida el uso de la configuración se muestra con un micromanipulador en la figura 1A & B. Mantenga el roedor como se muestra en la Figura 1C para proptosis temporal. Los pasos son los mismos si se realiza con el micromanipulador oa mano; éstas se representan en los dib…

Discussion

En este artículo se describe un método relativamente simple para realizar inyecciones subretinianas de células del EPR en suspensión en ratas y ratones. El protocolo es fácil de aprender y más experiencia con la técnica se traducirá en un menor número de traumas (Figura 3, lo que representa uno de los mejores inyecciones), especialmente si se utiliza un micromanipulador (Figura 1A). Cualquier trauma se puede monitorizar in vivo con un sistema de cSLO y OCT (Fig…

Materials

Name of Material/ Equipment (A-Z)	Company	Catalog Number	Comments/Description
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 mL x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 ug x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 mL x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 mL x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 gauge, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 mL x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 mL x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 mL x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 mL x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	100 mL x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 mL)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 gauge, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 mL x 1