Utföra subretinal injektioner i Gnagare att leverera pigmentepitelet celler i suspension

Summary

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Abstract

Omvandlingen av ljus till elektriska impulser sker i den yttre näthinnan och sker till stor del av tappar och stavar fotoreceptorer och retinal pigment epitel (RPE) celler. RPE ger kritiskt stöd för fotoreceptorer och död eller dysfunktion av RPE-celler är karakteristisk för åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), den vanligaste orsaken till bestående synnedsättning hos personer 55 år och äldre. Medan ingen bot för AMD har identifierats, kan implantation av friska RPE i sjuka ögon visa sig vara en effektiv behandling, och ett stort antal RPE-celler kan lätt genereras från pluripotenta stamceller. Flera intressanta frågor om säkerhet och effekt av RPE cell leverans kan fortfarande undersökas i djurmodeller, och väl erkända protokoll som används för att injicera RPE har utvecklats. Tekniken som beskrivs här har använts av flera grupper i olika studier och involverar att först skapa ett hål i ögat med en vass nål. Sedan en spruta med en blunt nål laddad med celler förs in genom hålet och passerade genom glaskroppen tills den vidrör RPE. Med hjälp av denna injektionsmetod, som är relativt enkel och kräver minimal utrustning, uppnår vi konsekvent och effektiv integration av stamcells härrörande RPE celler i mellan värd RPE som förhindrar betydande mängd ljusmätare degeneration i djurmodeller. Även om inte en del av själva protokoll, beskriver vi också hur man bestämmer omfattningen av det trauma som inducerats genom injektion, och hur man kan verifiera att de celler injicerades i subretinalområdet med hjälp av in vivo-avbildningsmetoder. Slutligen är användningen av detta protokoll inte begränsad till RPE-celler; den kan användas för att injicera varje förening eller cellen i subretinalområdet.

Introduction

The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly^1,2.

While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option^3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically^14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration^{16,18,21,22,25,28,29}. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing^30,31.

RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques^32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)³⁴. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill^{16,18,21,29,36,37}. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation³¹. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.³⁸)

The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.

Protocol

OBS: Alla djuren behandlas i enlighet med de etiska riktlinjer som fastställts av Scripps Research Institute. 1. Beredning av material för Injection (~ 20 min) Pre-varm cell dissociation lösning (helst en som är inaktiv genom utspädning, inte med serum), steril PBS, och odlingsmedier (tabell 1). Sterilisera sprutan med en trubbig nål genom att demontera det och koka delarna i vatten under 15 minuter. <p class="j…

Representative Results

Vi kan leverera en suspension av RPE-celler in i det subretinala utrymmet i gnagare snabbt och konsekvent användning av den teknik som beskrivs i detta manuskript. Även om det inte krävs, kan trauman kraftigt minimeras med hjälp av installations visas med en mikromanipulator i Figur 1A & B. Håll gnagare som visas i figur 1C för tillfällig proptosis. Stegen är desamma om de utförs med mikromanipulator eller för hand; Dessa visas i den tecknade i figur 1D. O…

Discussion

I den här artikeln beskriver vi en relativt enkel metod för att utföra subretinal injektioner av RPE celler i suspension i råttor och möss. Protokollet är lätt att lära och mer erfarenhet med tekniken kommer att översätta i färre trauman (Figur 3, vilket är en av de bättre injektioner), särskilt om en mikromanipulator används (Figur 1A). Varje trauma kan övervakas in vivo med en cSLO och oktober systemet (figur 2) om den är tillgänglig. Om hö…

Materials

Name of Material/ Equipment (A-Z)	Company	Catalog Number	Comments/Description
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 mL x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 ug x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 mL x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 mL x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 gauge, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 mL x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 mL x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 mL x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 mL x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	100 mL x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 mL)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 gauge, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 mL x 1