Herstel van de Adult zebravis Harten voor High-throughput Toepassingen

Summary

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Abstract

Gebruik van het zebravis modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling, regeneratie en ziekte zich uitstrekt tot gebruik van volwassen hart voor celdissociatie en zuivering van RNA, DNA en eiwitten. Al deze toepassingen vereisen het snelle herstel van aanzienlijke aantallen van de zebravis hart voor genregulerend, metabole en andere veranderingen die beginnen na de dood te voorkomen. Volwassen zebravissen harten zijn ook vereist voor het bestuderen hart structuur voor verschillende mutanten en voor het bestuderen hart regeneratie. Echter, de traditionele zebravis hart dissectie is traag en moeilijk en vereist gespecialiseerde gereedschappen, waardoor grootschalige dissectie van volwassen zebravissen harten vervelend. Traditionele methoden brengen ook het risico van beschadiging van het hart tijdens de dissectie. Hier beschrijven we een werkwijze voor dissectie van volwassen zebravissen harten die snel, reproduceerbaar en behoudt hart architectuur. Bovendien is deze methode niet gespecialiseerde hulpmiddelen nodig hebben, is pijnloos voor de zebravis,kan worden uitgevoerd op vers of vaste exemplaren, en kan worden uitgevoerd op de zebravis zo jong als een maand oud. De beschreven aanpak breidt het gebruik van volwassen zebravissen voor cardiovasculair onderzoek.

Introduction

Zebrafish are an excellent model for studying heart development and human disease^1,2. Specific advantages include the translucent nature of zebrafish embryos, the availability of many genetic mutants and transgenic reporter lines, and the availability of genome editing technologies. In addition to their advantages for studying early heart development, zebrafish are an ideal system for studying vertebrate heart regeneration³.

More recently, adult zebrafish are playing an important part in bioinformatics approaches to studying cardiovascular development and disease, due to their relatively large clutch size and relatively quick and inexpensive breeding compared to other vertebrate models. Promising techniques include ribosome profiling, RNA-Seq, and cell dissociation and FACS sorting^4-7. However, for these techniques the quality of the data can depend on obtaining a large number of samples in a rapid, efficient, and reproducible manner, before gene regulatory, metabolic, transcriptional, and other changes occur.

Dissection of adult zebrafish organs has been described in the past^8,9. However, previous approaches to dissection of the heart were slow, ran the risk of damaging the heart during dissection, required special tools, and/or required fixation of the zebrafish prior to dissection; for these reasons, past approaches to zebrafish adult heart dissection were not optimized for high-throughput applications and/or applications requiring fresh tissue.

Here, we describe a method for adult zebrafish heart dissection that is simple, fast, efficient, and reproducible, while preserving cardiac morphology. This method does not include cutting into the pericardial space and therefore does not risk damaging the heart during dissection. Instead, this method relies on anatomical landmarks of the zebrafish, and therefore, it is highly reproducible. This dissection method is also versatile in that it can be used on fresh or fixed fish, and on zebrafish as young as one month old. Finally, this method results in minimal suffering to the zebrafish because after anesthesia and/or rapid cooling, the fish is additionally decapitated and pithed in the course of the dissection procedure.

Protocol

LET OP: Zorg er altijd voor dat de goedkeuring IACUC of ethische commissie is op zijn plaats voor het begin van elke experimentele procedure met behulp van zebravis. 1. Bereid reagentia en setup Bereid de volgende oplossingen. Vind de recepten voor al deze oplossingen in standaard handboeken zebravis 10. 500 ml van het Ei Water 200 ml van 0,03% tricaïne in Egg Water 100 ml van 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) RBC Lyseerbu…

Representative Results

Met deze methode kan een volwassen zebravissen hart ontleed in minder dan 1 minuut, tegen ruim 5 min op traditionele wijze 8. Harten ontleed met behulp van deze methode betrouwbaar intact (Figuur 2A), terwijl de traditionele methoden 8 vereisen snijden blindelings in het hartzakje en daarom vaak beschadiging of verlies van het atrium of bulbusarteriosus (Figuur 2B) veroorzaken. Harten ontleed behouden hun structurele integriteit en zijn geschikt voor histologie <st…

Discussion

Hoewel werkwijzen voor het ontleden van de volwassen zebravissen hart zijn beschreven, deze werkwijzen zijn tijdrovend en meestal veroorzaakt schade aan het hart tijdens dissectie. Voor experimenten waarbij een groot aantal volwassen hart nodig zijn, uitvoeren en / of bij het voorkomen degradatie van hartweefsel is belangrijk voor downstreamtoepassingen, de benodigde tijd voor traditionele dissectie technieken onbetaalbaar. Evenzo reproduceerbaar verkrijgen onbeschadigde, intacte hart is belangrijk voor studie van harts…

Materials

small tank for transporting fish	Aquaneering	ZHCT100
fish net	Petsmart	36-16731
250mL glass beaker	Kimble	14005-250
9cm polystyrene petri dish	Nunc	172958
razor blade	Personna American Safety Razor Company	94-120-71
two Dumont #5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00
dissecting microscope	Olympus	SZX16
Tricaine	Sigma	A-5040
plastic transfer pipette	Thermo Scientific	202-20S
gooseneck light source	Dolan-Jenner Industries, Inc	Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
fluorescent light source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q	optional
micro-scissors	Biomedical Research Instruments, Inc	11-1000	optional
RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4333-57	optional