Recouvrement des adultes coeurs de poisson zèbre à haut débit pour des applications

Summary

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Abstract

Utilisation du système modèle pour étudier le développement du poisson zèbre, la régénération et la maladie est l'expansion vers l'utilisation de cœurs adultes pour la dissociation cellulaire et la purification de l'ARN, l'ADN et les protéines. Toutes ces applications exigent la reprise rapide d'un grand nombre de cœurs de poisson zèbre pour éviter gène régulateur, métabolique, et d'autres changements qui commencent après la mort. Coeurs poisson zèbre adultes sont également nécessaires pour étudier la structure de coeur pour une variété de mutants et pour étudier la régénération cardiaque. Cependant, la dissection traditionnelle cardiaque poisson zèbre est lente et difficile et nécessite des outils spécialisés, ce qui rend la dissection grande échelle des cœurs de poisson zèbre adultes fastidieux. Les méthodes traditionnelles abritent également le risque d'endommager le coeur lors de la dissection. Ici, nous décrivons une méthode pour la dissection des cœurs de poisson zèbre adultes qui est rapide, reproductible, et préserve l'architecture cardiaque. En outre, cette méthode ne nécessite pas d'outils spécialisés, est indolore pour le poisson-zèbre,peut être effectuée sur des échantillons frais ou fixes, et peut être effectuée sur le poisson zèbre dès l'âge de un mois. L'approche décrite élargit l'utilisation de poisson zèbre adulte pour la recherche cardiovasculaire.

Introduction

Zebrafish are an excellent model for studying heart development and human disease^1,2. Specific advantages include the translucent nature of zebrafish embryos, the availability of many genetic mutants and transgenic reporter lines, and the availability of genome editing technologies. In addition to their advantages for studying early heart development, zebrafish are an ideal system for studying vertebrate heart regeneration³.

More recently, adult zebrafish are playing an important part in bioinformatics approaches to studying cardiovascular development and disease, due to their relatively large clutch size and relatively quick and inexpensive breeding compared to other vertebrate models. Promising techniques include ribosome profiling, RNA-Seq, and cell dissociation and FACS sorting^4-7. However, for these techniques the quality of the data can depend on obtaining a large number of samples in a rapid, efficient, and reproducible manner, before gene regulatory, metabolic, transcriptional, and other changes occur.

Dissection of adult zebrafish organs has been described in the past^8,9. However, previous approaches to dissection of the heart were slow, ran the risk of damaging the heart during dissection, required special tools, and/or required fixation of the zebrafish prior to dissection; for these reasons, past approaches to zebrafish adult heart dissection were not optimized for high-throughput applications and/or applications requiring fresh tissue.

Here, we describe a method for adult zebrafish heart dissection that is simple, fast, efficient, and reproducible, while preserving cardiac morphology. This method does not include cutting into the pericardial space and therefore does not risk damaging the heart during dissection. Instead, this method relies on anatomical landmarks of the zebrafish, and therefore, it is highly reproducible. This dissection method is also versatile in that it can be used on fresh or fixed fish, and on zebrafish as young as one month old. Finally, this method results in minimal suffering to the zebrafish because after anesthesia and/or rapid cooling, the fish is additionally decapitated and pithed in the course of the dissection procedure.

Protocol

REMARQUE: Assurez-vous toujours que l'approbation IACUC ou comité d'éthique est en place avant de commencer toute procédure expérimentale utilisant le poisson zèbre. 1. Préparer les réactifs et configuration Préparer les solutions suivantes. Trouver les recettes pour l'ensemble de ces solutions dans les manuels de poisson zèbre standards 10. 500 ml d'eau Egg 200 ml de 0,03% tricaïne à Egg eau 1x 100 ml de tampon ph…

Representative Results

En utilisant cette méthode, un poisson zèbre cœur adulte peut être disséqué en moins de 1 min, par rapport à plus de 5 min selon la méthode traditionnelle 8. Coeurs disséqués en utilisant cette méthode sont fiable intacte (figure 2A), alors que les méthodes traditionnelles nécessitent huit coupe aveuglément dans le péricarde et donc souvent causer des dommages ou la perte de l'atrium ou bulbe artériel (figure 2B). Coeurs disséqués conservent l…

Discussion

Bien que les méthodes pour disséquer le cœur de poisson zèbre adulte ont été décrits, ces méthodes étaient de temps et souvent causé des dommages au cœur lors de la dissection. Pour effectuer des expériences où un grand nombre de coeurs adultes peuvent être nécessaires, et / ou lorsque éviter la dégradation du tissu cardiaque est important pour les applications en aval, le temps nécessaire en utilisant des techniques de dissection traditionnels est prohibitif. De même, l'obtention reproductible en…

Materials

small tank for transporting fish	Aquaneering	ZHCT100
fish net	Petsmart	36-16731
250mL glass beaker	Kimble	14005-250
9cm polystyrene petri dish	Nunc	172958
razor blade	Personna American Safety Razor Company	94-120-71
two Dumont #5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00
dissecting microscope	Olympus	SZX16
Tricaine	Sigma	A-5040
plastic transfer pipette	Thermo Scientific	202-20S
gooseneck light source	Dolan-Jenner Industries, Inc	Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
fluorescent light source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q	optional
micro-scissors	Biomedical Research Instruments, Inc	11-1000	optional
RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4333-57	optional