Återvinning av vuxna zebrafisk Hjärtan för hög genomströmning Applications

Summary

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Abstract

Användning av zebrafisk modellsystem för att studera utveckling, regenerering, och sjukdom expanderar mot användning av vuxna hjärtan för cell dissociation och rening av RNA, DNA och proteiner. Alla dessa applikationer kräver den snabba återhämtningen av betydande antal zebrafisk hjärtan att undvika genreglerande, metabola och andra förändringar som börjar efter döden. Vuxna zebrafisk hjärtan krävs också för att studera hjärtstruktur för en mängd olika mutanter och för att studera hjärtregenerering. Men den traditionella zebrafisk hjärta dissektion långsamt och svårt och kräver specialverktyg, vilket gör storskalig dissektion av vuxna zebrafisk hjärtan tråkiga. Traditionella metoder härbärgerar också risken för skador på hjärtat under dissekering. Här beskriver vi en metod för dissektion av vuxna zebrafisk hjärtan som är snabb, reproducerbar och bevarar hjärt arkitektur. Vidare har denna metod inte kräver specialiserade verktyg, är smärtfri för zebrafisk,kan utföras på färska eller fasta prover, och kan utföras på zebrafisk så unga som en månad gammalt. Den strategi som beskrivs utökar användningen av vuxna zebrafisk för kardiovaskulär forskning.

Introduction

Zebrafish are an excellent model for studying heart development and human disease^1,2. Specific advantages include the translucent nature of zebrafish embryos, the availability of many genetic mutants and transgenic reporter lines, and the availability of genome editing technologies. In addition to their advantages for studying early heart development, zebrafish are an ideal system for studying vertebrate heart regeneration³.

More recently, adult zebrafish are playing an important part in bioinformatics approaches to studying cardiovascular development and disease, due to their relatively large clutch size and relatively quick and inexpensive breeding compared to other vertebrate models. Promising techniques include ribosome profiling, RNA-Seq, and cell dissociation and FACS sorting^4-7. However, for these techniques the quality of the data can depend on obtaining a large number of samples in a rapid, efficient, and reproducible manner, before gene regulatory, metabolic, transcriptional, and other changes occur.

Dissection of adult zebrafish organs has been described in the past^8,9. However, previous approaches to dissection of the heart were slow, ran the risk of damaging the heart during dissection, required special tools, and/or required fixation of the zebrafish prior to dissection; for these reasons, past approaches to zebrafish adult heart dissection were not optimized for high-throughput applications and/or applications requiring fresh tissue.

Here, we describe a method for adult zebrafish heart dissection that is simple, fast, efficient, and reproducible, while preserving cardiac morphology. This method does not include cutting into the pericardial space and therefore does not risk damaging the heart during dissection. Instead, this method relies on anatomical landmarks of the zebrafish, and therefore, it is highly reproducible. This dissection method is also versatile in that it can be used on fresh or fixed fish, and on zebrafish as young as one month old. Finally, this method results in minimal suffering to the zebrafish because after anesthesia and/or rapid cooling, the fish is additionally decapitated and pithed in the course of the dissection procedure.

Protocol

OBS: Se alltid till att IACUC eller etisk kommitté godkännande är på plats innan du påbörjar någon experimentell procedur använder zebrafisk. 1. Förbered reagenser och installation Bered följande lösningar. Hitta recept för alla dessa lösningar i standardzebrafisk handböcker 10. 500 ml Egg Vatten 200 ml 0,03% Tricaine i Egg Vatten 100 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) RBC Lysis Buffer (tillval) Destinat…

Representative Results

Med denna metod kan en vuxen zebrafisk hjärta dissekeras på mindre än 1 minut, jämfört med över 5 min med traditionella metoder åtta. Hjärtan dissekerade med denna metod är tillförlitligt intakt (Figur 2A), medan traditionella metoder 8 kräver styckning blint in i hjärtsäcken och därmed ofta orsaka skada eller förlust av förmaket eller bulbus arteriosus (Figur 2B). Hjärtan dissekerade bibehålla sin strukturella integritet och är lämpliga för hi…

Discussion

Medan metoder för att dissekera den vuxna zebrafisk hjärta har beskrivits, var dessa metoder tidsödande och ofta orsakat skador på hjärtat under dissekering. För att utföra experiment där ett stort antal vuxna hjärtan kan behövas, och / eller när man undviker nedbrytning av hjärtvävnad är viktigt för tillämpningar efter, är orimlig den tid som krävs med traditionella dissektion tekniker. På samma sätt är viktigt för studier av hjärtstruktur och för immunhistokemiska och mikroskopimetoder reproduc…

Materials

small tank for transporting fish	Aquaneering	ZHCT100
fish net	Petsmart	36-16731
250mL glass beaker	Kimble	14005-250
9cm polystyrene petri dish	Nunc	172958
razor blade	Personna American Safety Razor Company	94-120-71
two Dumont #5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00
dissecting microscope	Olympus	SZX16
Tricaine	Sigma	A-5040
plastic transfer pipette	Thermo Scientific	202-20S
gooseneck light source	Dolan-Jenner Industries, Inc	Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
fluorescent light source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q	optional
micro-scissors	Biomedical Research Instruments, Inc	11-1000	optional
RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4333-57	optional