Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

Summary

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Abstract

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

Introduction

T-Lymphozyten sind kritische Komponenten des adaptiven Immunsystems. T-Zellen sind nicht nur direkt Vermittlung schützende Immunantworten gegen Pathogene durch eine Vielzahl von Effektor-Mechanismen, sondern auch aktiv Aufrechterhalten immunologischen Selbsttoleranz und Lenken der Antworten von anderen Zellen des Immunsystems verantwortlich. Diese Funktionen werden durch eine Reihe von integrierten Signale, einschließlich T-Zell-Rezeptor (TCR), Ligation, Zytokine und Chemokine und Metaboliten ¹ gerichtet. Dieser Signale ist von besonderer Bedeutung der TCR, da sie die charakteristische Besonderheit, die die Rolle der T-Zellen in der adaptiven Immunität definiert. Ein TCR wechselwirkt mit linearen Peptids durch MHC-Antigene (HLA menschliche Ortholog) Moleküle (pMHC-Komplexe) in eine hochspezifische und empfindliche Weise dargestellt, um die Signale, die T-Zell-Effektor-Funktion zu initiieren. Die biochemischen Parameter des TCR Wechselwirkungen mit pMHC Liganden bieten nicht nur die Spezifität für TZellaktivierung, sondern auch über eine qualitative Wirkung auf nachfolgende T-Zell-Funktion ^2. So studieren T-Zell-Funktion erfordert häufig die Prüfung der Antworten der klonalen T-Zellen mit definierten Antigenspezifität.

Das menschliche T-Zell-Kompartiment, die ungefähr 10 ¹² αβ T-Zellen, enthält schätzungsweise ^{7. Oktober} – ^{8. Oktober} deutliche αβTCRs ^3-4. Diese vielfältigen Repertoire bietet Gelegenheit für die Anerkennung der Vielzahl von Peptiden, die von potenziellen Krankheitserregern, die eine T-Zell-Antwort für eine schützende Immunität erfordern würden. Es wird geschätzt, daß die Frequenz von T-Zellen reagieren auf eine gegebene Fremdantigen durch Selbst MHC präsentiert wird, ist in der Größenordnung von 10 ^-4 – 10 ^-7 in der ohne vorherige Immunantwort auf dieses Antigen ^5. Die naive T-Zell-Repertoire von Thymus Auswahl geformt, um die Fähigkeit zur Selbst-MHC-Antigene erkennen und präsentieren Peptide Grenze reagiert werdenduktivität gegen Selbstpeptidantigene, die Maximierung der potenziellen Nutzen für die Vermittlung eine schützende Immunität ^2. Unter Verstoß gegen diese entwickelt Reaktivität, eine relativ große Frequenz, 10 ^-3 jedoch – 10 ^-4, der T-Zellen aus immunologisch naive Individuen reagieren auf die Stimulation mit allogenen Zellen, erkennen sowohl die fremden MHC-Moleküle sowie die endogene Peptide präsentieren sie ^6. Die Erkennung von allogenen pMHC Liganden ist strukturell ähnlich der Erkennung von fremden Antigenen durch Selbst-MHC präsentiert; Die TCR macht kritischen biochemischen Wechselwirkungen sowohl mit dem allogenen MHC-Molekül als auch die Peptid ⁷ dargestellt. Die robuste Natur der Reaktion der T-Zellen allogene Stimulierung resultiert aus der Vielfalt der pMHC-Komplexen auf der Oberfläche einer allogenen Zellen ⁸ vorhanden. Es wird geschätzt, dass jedes MHC präsentiert etwa 2 x 10 ⁴ unterschiedlichen endogenen Peptidantigene ^9. Diese breadth der Antwort auf allogene Stimulation ist ein wesentlicher Aspekt der klinisch relevanten Pathologie, wie etwa Transplantatabstoßung oder Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD), von T-Zell-Alloreaktivität resultieren.

Untersuchung der menschlichen T-Zellantworten alloreaktiven traditionell durch Prüfung polyklonalen Reaktionen von naiven T-Zellen nach Stimulation mit allogenen Zellen verlassen. Wiederholte Stimulierung mit dem gleichen allogenen Zelllinie zusammen mit Grenzverdünnungsanalyse ist in der Lage klonalen T-Zellen mit definierten Erkennung von allogenen HLA ^10. Jedoch ist dieser Ansatz problematisch für die Prüfung Antworten auf individuelle allogenen pMHC-Liganden, da die großen und vielfältigen Repertoire von endogenen pMHC-Komplexe für eine gegebene allogenen HLA vorliegenden stimuliert ein breites Repertoire an T-Zellen. Diese Massenpopulation Stimulation und Grenzverdünnungs Ansatz Screening einer großen Anzahl von Klonen erforderlich T-Zellen mit der gewünschten Reacti isolierenvität gegen einen einzelnen pMHC Liganden. Zusätzlich ist die Häufigkeit von T-Zellen reagieren auf eine einzelne allogenen pMHC Ligand unter naive T-Zell-Populationen, die ein Hindernis für die effiziente Erzeugung von menschlichen T-Zell-Klone, die auf ein gegebenes Antigen präsentiert relativ gering.

Identifizierung und Isolierung von Antigen-spezifischen T-Zellen von polyklonalen Populationen wurden durch die Entwicklung von Fluorophor-markierten pMHC Multimere ¹¹ aktiviert. Dieser Ansatz nutzt spezifische Peptidantigene in rekombinanten löslichen biotinylierten MHC-Moleküle, die durch Bindung an Streptavidin-markierten Fluorophor markiert werden geladen. Multimerisierung pMHC erhöht die Gier, Kompensieren des intrinsisch niedrigen (uM) Affinität der TCR für lösliche pMHC Liganden. Markierten Zellen identifiziert und mittels Durchflusszytometrie getrennt werden. Jedoch ist dieser Ansatz noch von der niedrigen Frequenz von Antigen-spezifischen T-Zellen unter naive T-Zell-Populationen, die in der Regel begrenztum Größenordnungen geringer als die Grenze der genaue Identifizierung und Quantifizierung der meisten Durchflusszytometer. Um diese Einschränkung zu beheben, wurde ein Verfahren zum pMHC Tetramer Kennzeichnung und anschließende magnetische Perle Bereicherung Tetramer-markierten Zellen wurden ¹² entwickelt. Dieses Verfahren hat eine zuverlässige Erkennung, Zählung und Isolierung des Niederfrequenz-Antigen-spezifischen T-Zellen nachgewiesen.

Dieses Protokoll beschreibt ein wirksames Protokoll für die Herstellung von menschlichen T-Zell-Klone, die spezifisch auf einzelne allogenen pMHC-Liganden reagieren. Das Protokoll gilt pMHC (HLA) Multimer Kennzeichnung und Anreicherung für die Isolierung von Alloantigen-spezifischer menschlicher T-Zellen mit Durchflusszytometrie und Zellsortierung einem robusten Verfahren zur in vitro Kultur von humanen T-Zellen, die Produktion von T-Zell-Klonen, die aus Einzelzellen sortiert (Freigabe Übersicht in Figur 1).

Protocol

HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert die Verwendung von peripheren Blutproben von Probanden. Alle Forschung mit menschlichen Probanden sollten überprüft und durch eine Menschen Studies Institutional Review Board genehmigt, um die Einhaltung der Deklaration von Helsinki (2013) und dem Health Insurance Portability and Accountability Act von 1996 zu gewährleisten. 1. Isolierung von T-Zellen aus Vollblut Vor dem Start, warm das Dichtegradienten-Medium auf Raumtemperatur. Aliquot 4 m…

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung klonaler menschlichen T-Zellkulturen mit Alloantigen Spezifität über eine Magnetperle Anreicherung und Einzelzell Durchflusszytometrie Sortierstrategie festgelegt. Abbildung 1 gibt einen Überblick über den Prozess. Figur 1: Protokoll Sicht Das hier beschriebene Protokoll stellt ein zuverlässiges Ve…

Discussion

T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm	Becton, Dickenson and Company	366480
Lymphoprep	Stemcell Technologies	7801
Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit	Stemcell Technologies	15061
Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg	Corning	21-031-CV
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
EDTA	Sigma-Aldrich	E6635
Fluorophore-labeled pMHC tetramer	NIH Tetramer Facility	NA
EasySep Biotin Selection Kit	Stemcell Technologies	18553
EasySep Selection magnet	Stemcell Technologies	18000
TruStain FcX Human Fc blocking solution	Biolegend	422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2)	Biolegend	300621
Anti-CD14 FITC (clone HCD14)	Biolegend	325603
Anti-CD19 FITC (clone HIB19)	Biolegend	302205
Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine	Corning	15-016-CV
HEPES	Corning	25-060-CI
b-Mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Glutamax	Life Technologies	35050061
Gentamicin sulfate (50 mg/ml)	Omega Scientific	GT-50
Human AB serum, male donor	Omega Scientific	HS-30
Recombinant human IL-2	Peprotech	AF 200-02
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Life Technologies	11131D
Media
Cell sorting buffer
PBS, pH 7.4	1 L
BSA	10g
EDTA (0.5 M)	2 ml
Human T Cell Culture Medium
Iscove's DMEM	351.6 ml
Heat-inactivated human AB serum	40 ml
HEPES (1 M)	4 ml
Glutamax (100 x)	4 ml
Gentamicin (50 mg/ml)	0.4 ml
b-mercaptoethanol (14.3 M)	1.4 ml
Recombinant human IL-2 (1 mg/ml)	1 ml