Os ensaios de esferas in vitro são comumente usados para identificar células-tronco cancerígenas. Aqui, comparamos ensaios de esferas únicas com multicélulas. Os ensaios baseados em células únicas mais trabalhosos ou a suplementação de metilcelulose fornecem resultados mais precisos, enquanto os ensaios baseados em várias células realizados em meio líquido podem ser altamente influenciados pela densidade celular.
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Artigo de método
Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios
Neste artigo
Resumo
Resumo
Anos de pesquisa indicam que os cânceres de ovário abrigam uma mistura heterogênea de células, incluindo uma subpopulação das chamadas "células-tronco cancerígenas" (CSCs) responsáveis pela iniciação, manutenção e recidiva do tumor após quimioterapias convencionais. A identificação de CSCs ovarianos é, portanto, um objetivo importante. Um método comumente usado para avaliar o potencial de CSC in vitro é o ensaio de esferas no qual as células são plaqueadas em condições de cultura não aderentes em meio livre de soro suplementado com fatores de crescimento e a formação de esferas é pontuada após alguns dias. Aqui, revisamos os protocolos atualmente disponíveis para ensaios de esferas de câncer de ovário humano e realizamos uma análise lado a lado entre os ensaios baseados em várias células comumente usados e um sistema mais preciso baseado em placas de células únicas. Nossos resultados indicam que tanto os ensaios baseados em células múltiplas quanto os de esferas baseadas em células únicas podem ser usados para investigar a formação de esferas in vitro. Os ensaios baseados em células únicas, mais trabalhosos e caros, são mais adequados para a avaliação funcional de células individuais e levam a resultados gerais mais precisos, enquanto os ensaios baseados em várias células podem ser fortemente influenciados pela densidade das células plaqueadas e requerem experimentos de titulação antecipadamente. A suplementação de metilcelulose para ensaios baseados em múltiplas células pode ser efetivamente usada para reduzir artefatos mecânicos.
Introdução
Há evidências crescentes de que os carcinomas de ovário são compostos por misturas heterogêneas de células e abrigam as chamadas "células-tronco cancerígenas" (CSCs) responsáveis pelo início, manutenção e recidiva da doença após terapias citotóxicas convencionais1-3. Portanto, o desenvolvimento de estratégias moleculares direcionadas às CSCs de ovário é um objetivo importante e promete melhorar a terapia de pacientes com câncer de ovário.
Um pré-requisito para a compreensão das características moleculares das CSCs é seu isolamento confiável das não-CSCs. No entanto, a identificação de CSCs ovarianos parece desafiadora. Embora a e....
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Protocolo
1. Geração de células humanas de carcinoma de ovário OVCAR-3 estavelmente transduzidas com Lentiviruses Contendo o Reporter Construct SOX2 Região Regulatory
- Gerar partículas lentivirais por transfecção da linha celular 293T HEK-embalagem com uma construção repórter reconhecer uma região reguladora SOX2 como descrito 10,21.
NOTA: O repórter construir contém ainda um domínio desestabilização do System Shield ProteoTuner à frente da proteína tdTomato fluorescência. Shield1 se liga ao domínio desestabilização impedindo assim o proteassoma para degradar a proteína de fluorescência 22. - Transduzir células O....
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Resultados
Em ensaios de esferas convencionais, cerca de 40% de RFP + OVCAR-3 células vs. 20% de células RFP- deu origem a uma esfera tumor individual no ensaio de esferas primário (Figura 4A). Além disso, as esferas formadas por RFP + células eram maiores em tamanho do que os que são formados por células RFP-.
Quando colocadas em ensaios baseados em células individuais, células RFP + também formou mais esferas do que as células RFP-, confirmando os resultados acima. No entanto, havia .......
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Discussão
Esferas culturas é um método amplamente utilizado para testar o potencial de células estaminais do cancro e para enriquecer as células estaminais do tipo em uma ampla variedade de células tumorais humanas 15,25,26. Sob estas condições de cultura, as células cancerosas que não têm capacidade de auto-renovação são esperados para diferenciar e eventualmente sofrem morte celular. Embora eles podem, inicialmente, formar grupos de células tumorais ou mesmo esferas especialmente em ensaios preliminares, eles não são.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Baden-Württemberg Stiftung (Programa II de Células-Tronco Adultas) concedida a C.L. Agradecemos à Dra. Martina Konantz pela contribuição crítica e revisão do manuscrito. Agradecemos a Emmanuel Traunecker e Toni Krebs do DBM FACS Facility (Hospital Universitário de Basileia) pela assistência na classificação do FACS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de baixa fixação | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulina | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hidrocortisona | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | concentração final: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | concentração final: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | concentração final: 1X |
| Heparina-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | diluição 1:1.000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco' s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | diluição 1: 1.000 |
| DMEM / F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM / F12 (pó) | Gibco | 42400-010 | |
| Metilcelulose | Sigma | M0387 | |
| Cloridrato de puromicina | Applichem | A2856 | |
| Cell classificador | BD | Aria III classificador de células | |
| FACS analisador | BD | Accuri c6 citômetro de fluxo | |
| Microscópio | Olympus | IX50 Osiris |
Referências
- Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Ahmed, ....
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Reimpressões e permissões
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