Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.
Eiwitstabiliteit invloed op vele aspecten van de biologie, en het meten van de klaringskinetiek van eiwitten kan belangrijke inzichten verschaffen in biologische systemen. In FDAP experimenten, kan de klaring van eiwitten in levende organismen worden gemeten. Een eiwit van belang wordt gelabeld met een photoconvertible fluorescent eiwit expressie in vivo en photoconverted, en de daling van de photoconverted signaal over de tijd wordt gecontroleerd. De gegevens worden vervolgens voorzien van een geschikt klaringsmodel de halfwaardetijd van het eiwit te bepalen. Belangrijk is dat de klaringskinetiek eiwit populaties in verschillende compartimenten van het organisme worden afzonderlijk door toepassing compartimentele maskers onderzocht. Deze benadering is gebruikt om de intra- en extracellulaire halfwaardetijden van uitgescheiden signaaleiwitten bepaalt gedurende ontwikkeling van de zebravis. We beschrijven hier een protocol voor FDAP experimenten in de zebravis embryo's. Het moet mogelijk zijn om FDAP om de kinetiek van de klaring bepalenelke taggable eiwit in elk optisch toegankelijke organisme.
De niveaus van proteïnen in cellen en organismen worden bepaald door de productiesnelheden en klaring. Eiwit halfwaardetijden kan variëren van enkele minuten tot dagen 1-4. In veel biologische systemen, de stabilisatie of klaring van belangrijke eiwitten heeft belangrijke gevolgen voor de cellulaire activiteit. Modulatie van intracellulair eiwit stabiliteit vereist voor celcyclusprogressie 5,6, ontwikkelings signalering 7-9, apoptose 10 en normale functie en onderhoud van neuronen 11,12. Extracellulaire proteïne stabiliteit beïnvloedt de verdeling en de beschikbaarheid van uitgescheiden eiwitten zoals morfogenen 13,14 binnen een weefsel.
In de afgelopen decennia heeft eiwitstabiliteit vooral beoordeeld in celkweek met behulp van radioactieve pulse-labeling of cycloheximide chase experimenten 15. In dergelijke pulse-chase experimenten worden cellen hetzij tijdelijk blootgesteld aan een "puls" van radioactieve aminozuurvoorlopers die zijn opgenomen in nieuw gesynthetiseerde eiwitten of ze worden blootgesteld aan cycloheximide, die eiwitsynthese remt. Gekweekte cellen worden dan verzameld op verschillende tijdstippen, en hetzij immunoprecipitatie gevolgd door autoradiografie (radioactieve pulse-chase experimenten) of western blotting (in cycloheximide experimenten) wordt gebruikt om de klaring van eiwit kwantificeren tijd.
Conventionele eiwitstabiliteit assays meerdere tekortkomingen. Eerst eiwitten in deze assays worden vaak niet uitgedrukt in hun endogene omgevingen, maar in weefselkweek en soms van verschillende species. Voor eiwitten waarvan de stabiliteit is contextafhankelijk deze benadering problematisch. Ten tweede is het niet mogelijk om eiwitten speling in individuele cellen of organismen te volgen in de tijd en de gegevens van deze testen geeft een gemiddelde van verschillende populaties van cellen op verschillende tijdstippen. Aangezien individuele cellen kan zijn begonnenmet verschillende hoeveelheden eiwit, mogen hebben de radioactieve merker of cycloheximide op verschillende tijdstippen, of kunnen verschillend klaringskinetiek, zoals geaggregeerde gegevens misleidend kunnen zijn. Tenslotte, bij cycloheximide chase experimenten toevoeging van de eiwitsyntheseremmer kan onbedoelde fysiologische effecten die kunstmatig eiwit stabiliteit 16-18 kunnen veranderen hebben. Deze gebreken kunnen worden vermeden door gebruik fluorescentievervaltijd Na Photoconversion (FDAP), een techniek die gebruik maakt photoconvertible eiwitten proteïne klaring dynamisch meten levende organismen 19-25 (zie bespreking beperkingen van de FDAP techniek).
Photoconvertible eiwitten zijn fluorescerende eiwitten waarvan excitatie en emissie-eigenschappen veranderen na blootstelling aan specifieke golflengten van het licht 26. Een vaak gebruikte variant is Dendra2, een "groen-to-rode" photoconvertible eiwit dat in eerste instantie heeft excitatie en emissie eigenschappen vergelijkbaar groen fluorescerende eiwitten, maar na blootstelling aan UV licht- "fotoconversie" -haar excitatie- / emissie-eigenschappen worden vergelijkbaar met die van rode fluorescente proteïnen 23,27. Belangrijk is dat nieuwe eiwit geproduceerd na photoconversion niet hetzelfde excitatie / emissie-eigenschappen als de photoconverted eiwit, waardoor ontkoppeling van de productie en de klaring na photoconversion en observatie van slechts een pool van photoconverted eiwit. Tagging eiwitten van belang met photoconvertible eiwitten biedt dus een handige manier om de pulse-label eiwitten in intacte, optisch toegankelijke levende organismen.
In FDAP assays (figuur 1A), is een eiwit van belang gelabeld met een photoconvertible eiwit en uitgedrukt in een levend organisme (Figuur 1B). Het fusie-eiwit wordt photoconverted en de daling photoconverted signaal over de tijd wordt gecontroleerd door fluorescence microscopie (figuur 1C). De gegevens worden vervolgens voorzien van een geschikt model om de halfwaardetijd van het fusie-eiwit (figuur 1D) te bepalen.
De FDAP assay beschreven is ontworpen om het extracellulaire halfwaardetijden van uitgescheiden signaaleiwitten in zebravisembryo bepalen tijdens de vroege embryogenese 19. Echter, kan deze benadering worden aangepast aan elke transparante modelorganisme dat live beeldvorming tolereert, en kunnen worden gebruikt om de klaring van taggable intracellulair of extracellulair eiwit controleren. Variaties van de hier beschreven techniek zijn uitgevoerd in gekweekte cellen 20,23 pt Drosophila 22 en muis 21 embryo.
Het succes van een FDAP proef berust op het genereren van een functioneel photoconvertible fusieproteïne. Tagging een eiwit kan zijn biologische activiteit en / of biofysische eigenschappen, zoals de lokalisatie, oplosbaarheid en stabiliteit 36-41 beïnvloeden. Wees bereid om de activiteit van verschillende fusieconstructen testen om een die actief is te vinden. Wij hebben gevonden dat de positie van de photoconvertible eiwit ten opzichte van het eiwit van interesse of met meer linkers (bijvoorbeel…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag Jeffrey Farrell, James Gagnon, en Jennifer Bergmann bedanken voor commentaar op het manuscript. KWR werd gesteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program tijdens de ontwikkeling van de FDAP test. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH aan AFS en door subsidies van de Duitse Stichting voor Onderzoek (Emmy Noether Program), het Max Planck Instituut en het Human Frontier Science Program (Career Development Award) naar PM.
PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) | To generate capped mRNA for injection into embryos | ||
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks | ||
6-well plastic dish (BD Falcon) | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | ||
Embryo medium | 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage | ||
5 cm diameter glass petri dish | For embryo dechorionation | ||
200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use | ||
Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos | ||
Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 | ||
15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | ||
Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
25x or 40x water objective | Objective for imaging | ||
10x air objective | Objective for photoconversion | ||
Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |