Photoconversion के बाद प्रतिदीप्ति क्षय का प्रयोग लिविंग zebrafish भ्रूण में प्रोटीन स्थिरता मापने (FDAP)
Summary
कोशिकाओं और ऊतकों में प्रोटीन का स्तर अक्सर कसकर प्रोटीन के उत्पादन और निकासी का संतुलन द्वारा विनियमित रहे हैं। Photoconversion (FDAP) के बाद प्रतिदीप्ति क्षय का प्रयोग, प्रोटीन की निकासी कैनेटीक्स प्रयोगात्मक विवो में मापा जा सकता है।
Abstract
प्रोटीन स्थिरता जीव विज्ञान के कई पहलुओं को प्रभावित करती है, और प्रोटीन की निकासी कैनेटीक्स को मापने जैविक प्रणालियों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। FDAP प्रयोगों में, रहने वाले जीवों के भीतर प्रोटीन की निकासी मापा जा सकता है। ब्याज की एक प्रोटीन, एक photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग विवो में व्यक्त किया और photoconverted, और समय के साथ photoconverted संकेत में कमी नजर रखी है। डेटा तो प्रोटीन आधा जीवन को निर्धारित करने के लिए एक उचित निकासी मॉडल के साथ फिट है। महत्वपूर्ण बात है, जीव के विभिन्न डिब्बों में प्रोटीन आबादी की निकासी कैनेटीक्स पूरक मास्क लगाने से अलग से जांच की जा सकती है। यह दृष्टिकोण zebrafish विकास के दौरान स्रावित संकेत प्रोटीन की intra- और बाह्य आधा जीवन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ, हम zebrafish भ्रूण में FDAP प्रयोगों के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। यह की निकासी कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए FDAP उपयोग करने के लिए संभव होना चाहिएकिसी भी ऑप्टिकली सुलभ जीव में किसी भी taggable प्रोटीन।
Introduction
कोशिकाओं और जीवों में प्रोटीन के स्तर पर उत्पादन और निकासी की उनके दरों से निर्धारित होते हैं। प्रोटीन आधा जीवन मिनट से दिनों 1-4 तक हो सकती है। कई जैविक प्रणालियों में, कुंजी प्रोटीन का स्थिरीकरण या निकासी सेलुलर गतिविधि पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। इंट्रासेल्युलर प्रोटीन स्थिरता के मॉड्यूलेशन कोशिका चक्र प्रगति 5,6, विकासात्मक संकेतन 7-9, apoptosis के 10, और सामान्य कार्य और न्यूरॉन्स 11,12 के रखरखाव के लिए आवश्यक है। कोशिकी प्रोटीन स्थिरता एक ऊतक के भीतर वितरण और ऐसे morphogens 13,14 के रूप में स्रावित प्रोटीन की उपलब्धता को प्रभावित करता है।
पिछले कुछ दशकों में, प्रोटीन स्थिरता मुख्य रूप से रेडियोधर्मी पल्स-लेबलिंग या cycloheximide पीछा प्रयोगों 15 का उपयोग करते हुए सेल संस्कृति में मूल्यांकन किया गया है। ऐसे पल्स-पीछा प्रयोगों में, कोशिकाओं या तो क्षणिक एक रेडियोधर्मी अमीनो की "पल्स" को उजागर कर रहे हैंएसिड व्यापारियों नए संश्लेषित प्रोटीन में शामिल कर रहे हैं, या वे प्रोटीन संश्लेषण को रोकता है जो cycloheximide, को उजागर कर रहे हैं। संवर्धित कोशिकाओं तो अलग समय बिंदुओं पर एकत्र कर रहे हैं, और या तो (रेडियोधर्मी पल्स-पीछा प्रयोगों में) autoradiography द्वारा पीछा immunoprecipitation या (cycloheximide प्रयोगों में) सोख्ता पश्चिमी समय के साथ प्रोटीन की निकासी यों के लिए प्रयोग किया जाता है।
परम्परागत प्रोटीन स्थिरता assays के कई कमियों है। सबसे पहले, इन assays में प्रोटीन अक्सर अपने अंतर्जात वातावरण में व्यक्त नहीं कर रहे हैं, बल्कि विभिन्न प्रजातियों से कोशिकाओं में टिशू कल्चर में है और कभी कभी। जिसका स्थिरता संदर्भ पर निर्भर है प्रोटीन के लिए, इस दृष्टिकोण समस्याग्रस्त है। दूसरा, यह समय के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं या जीवों में प्रोटीन निकासी का पालन करने के लिए संभव नहीं है, और इन assays से डेटा अलग समय बिंदुओं पर कोशिकाओं के विभिन्न आबादी के एक औसत को दर्शाता है। व्यक्ति की कोशिकाओं शुरू हो सकता है के बाद सेप्रोटीन के विभिन्न मात्रा के साथ, अलग अलग समय पर रेडियोधर्मी लेबल या cycloheximide ले लिया है हो सकता है, या अलग निकासी कैनेटीक्स, इस तरह कुल डेटा को गुमराह किया जा सकता है हो सकता है। अंत में, cycloheximide पीछा प्रयोगों के मामले में, प्रोटीन संश्लेषण अवरोध करनेवाला के अलावा कृत्रिम रूप से प्रोटीन स्थिरता 16-18 बदल सकता है कि अनायास ही मनोवैज्ञानिक प्रभाव पड़ सकता है। इन कमियों को, photoconversion (FDAP) के बाद photoconvertible प्रोटीन जीवों 19-25 जीने में गतिशील रूप से प्रोटीन निकासी को मापने के लिए इस्तेमाल करता है कि एक तकनीक प्रतिदीप्ति क्षय का उपयोग करके बचा जा सकता है (FDAP तकनीक की सीमाओं के लिए चर्चा देखें)।
Photoconvertible प्रोटीन जिसका उत्तेजना और उत्सर्जन गुण प्रकाश 26 के विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के लिए जोखिम के बाद बदल फ्लोरोसेंट प्रोटीन होते हैं। एक आमतौर पर इस्तेमाल किया संस्करण Dendra2, शुरू में पूर्व की है कि एक "हरी-टू-लाल" photoconvertible प्रोटीन हैप्रशस्ति पत्र और उत्सर्जन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए इसी तरह की संपत्ति है, लेकिन यूवी प्रकाश "photoconversion" को प्रदर्शन के बाद उत्तेजना -its / उत्सर्जन गुण लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन 23,27 के समान हो गया है। महत्वपूर्ण बात है, photoconversion के बाद का उत्पादन नए प्रोटीन photoconverted प्रोटीन का केवल एक पूल के photoconversion पर उत्पादन और निकासी की decoupling और अवलोकन की अनुमति है, photoconverted प्रोटीन के रूप में एक ही उत्तेजना / उत्सर्जन गुण नहीं होगा। Photoconvertible प्रोटीन के साथ ब्याज की प्रोटीन टैगिंग इस प्रकार पल्स-लेबल को बरकरार, ऑप्टिकली सुलभ रहने वाले जीवों में प्रोटीन एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है।
FDAP assays के (चित्रा 1 ए) में, ब्याज की एक प्रोटीन एक photoconvertible प्रोटीन के साथ टैग है और एक जीवित जीव (चित्रा 1 बी) में व्यक्त की है। संलयन प्रोटीन photoconverted है, और समय के साथ photoconverted संकेत में कमी fluorescen द्वारा नजर रखी हैसीई माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1C)। डेटा तो संलयन प्रोटीन (चित्रा -1) के आधे जीवन को निर्धारित करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल के साथ फिट है।
यहाँ वर्णित FDAP परख जल्दी embryogenesis 19 के दौरान zebrafish भ्रूण में स्रावित संकेत प्रोटीन की कोशिकी आधा जीवन का निर्धारण करने के लिए डिजाइन किया गया था। हालांकि, इस दृष्टिकोण रहते इमेजिंग बर्दाश्त, और किसी भी taggable इंट्रासेल्युलर या बाह्य प्रोटीन की निकासी पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि किसी भी पारदर्शी मॉडल जीव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यहाँ वर्णित तकनीक के बदलाव संवर्धित कोशिकाओं 20,23 और ड्रोसोफिला 22 और माउस 21 भ्रूण में प्रदर्शन किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक FDAP प्रयोग की सफलता के लिए एक कार्यात्मक photoconvertible संलयन प्रोटीन की पीढ़ी पर निर्भर करता है। एक प्रोटीन टैगिंग अपने जैविक गतिविधि और / या इसके स्थानीयकरण, विलेयता, और स्थिरता 36-41 सहित biophysical गुणों को प्रभ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए जेफरी फैरेल, जेम्स Gagnon, और जेनिफर Bergmann को धन्यवाद देना चाहूंगा। KWR FDAP परख के विकास के दौरान राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया। इस काम एएफएस एनआईएच से अनुदान द्वारा और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (एमी नोथेर कार्यक्रम), मैक्स प्लैंक सोसायटी, और प्रधानमंत्री के लिए मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम (कैरियर विकास पुरस्कार) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) | To generate capped mRNA for injection into embryos | ||
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks | ||
| 6-well plastic dish (BD Falcon) | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | ||
| Embryo medium | 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage | ||
| 5 cm diameter glass petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use | ||
| Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos | ||
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 | ||
| 15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | ||
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25x or 40x water objective | Objective for imaging | ||
| 10x air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
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