Måling Protein Stabilitet på Living Sebrafisk embryo med fluoresens Decay Etter Photoconversion (FDAP)

Summary

Proteinnivåer i celler og vev er ofte strengt regulert av balansen av proteinproduksjon og klaring. Ved hjelp av fluorescens Decay Etter Photoconversion (FDAP), kan klaringskinetikk av proteiner bli eksperimentelt målt in vivo.

Abstract

Protein stabiliteten påvirker mange aspekter av biologi, og måle klaring kinetikk av proteiner kan gi viktig innsikt i biologiske systemer. I FDAP eksperimenter, kan clearance av proteiner i levende organismer måles. Et protein av interesse er merket med en photoconvertible fluorescerende protein, uttrykt in vivo og photoconverted, og reduksjonen i photoconverted signal over tid blir overvåket. Dataene blir deretter utstyrt med en passende klaring modell for å bestemme protein halveringstid. Viktigere, kan klaringskinetikk protein populasjoner i ulike avdelinger av organismen undersøkes separat ved å bruke compartment masker. Denne fremgangsmåten har blitt brukt for å bestemme de intra- og ekstracellulære halveringstider på utskilte signaleringsproteiner under sebrafisk utvikling. Her beskriver vi en protokoll for FDAP eksperimenter i sebrafisk embryoer. Det bør være mulig å bruke FDAP å bestemme klareringskinetikkennoen taggable protein i noen optisk tilgjengelig organisme.

Introduction

Nivåene av proteiner i celler og organismer er bestemt av deres produksjonshastigheter og klaring. Protein halveringstider kan variere fra minutter til dager ^1-4. I mange biologiske systemer, har stabilisering eller klarering av viktige proteiner viktige effekter på celleaktivitet. Modulering av intracellulær proteinstabilitet er nødvendig for cellesyklusprogresjon ^5,6, utviklingssignale ^7-9, apoptose ^10, og normal funksjon og vedlikehold av neuroner ^11,12. Ekstracellulært proteinstabilitet påvirker fordelingen og tilgjengeligheten av utskilte proteiner, som for eksempel morphogens ^13,14, i en vev.

I løpet av de siste tiårene, har protein stabilitet hovedsakelig blitt vurdert i cellekultur ved hjelp av radioaktiv puls-merking eller Cycloheximide jage eksperimenter ^15. I slike puls-chase eksperimenter ble cellene enten forbigående utsettes for en "puls" av radioaktiv aminosyresyreforløpere som blir innlemmet i de nylig syntetiserte proteiner, eller de er utsatt for cykloheksimid, som inhiberer proteinsyntese. Dyrkede celler ble deretter oppsamlet ved forskjellige tidspunkter, og enten etterfulgt av immunoutfelling autoradiografi (i radioaktive puls-chase eksperimenter), eller Western blotting (i cykloheksimid forsøk) blir brukt til å kvantifisere klaring av protein over tid.

Konvensjonelle analyser protein stabilitet har flere svakheter. Først blir proteiner i disse analyser ofte ikke uttrykt i deres endogene miljøer, men heller i vevskultur, og noen ganger i celler fra forskjellige arter. For proteiner hvis stabilitet er kontekstavhengig, er denne tilnærmingen problematisk. For det andre er det ikke mulig å følge proteinet klaring i de enkelte celler eller organismer over tid, og dataene fra disse analysene reflekterer et gjennomsnitt av forskjellige populasjoner av celler ved forskjellige tidspunkter. Siden individuelle celler kan ha startetmed forskjellige mengder protein, kan ha tatt opp radioaktivt etikett eller cykloheksimid til forskjellige tider, eller kan ha ulike klareringskinetikk, slike aggregerte data kan være misvisende. Endelig, i tilfellet med cykloheksimid chase eksperimenter, kan tilsetningen av proteinsynteseinhibitor ha uønskede fysiologiske effekter som kunstig kunne forandre proteinstabilitet ^16-18. Disse mangler kan unngås ved å bruke fluorescens Råte Etter Photoconversion (FDAP), en teknikk som utnytter photoconvertible proteiner for å måle protein klaring dynamisk i levende organismer ^19-25 (se diskusjon for begrensninger av FDAP teknikk).

Photoconvertible proteiner er fluorescerende proteiner som eksitasjon og utslipps egenskaper endre seg etter eksponering for bestemte bølgelengder av lys ^26. En vanlig brukt variant er Dendra2, en "grønn-til-rød" photoconvertible protein som i utgangspunktet har exsitering og utslipps egenskaper som ligner på grønne fluorescerende proteiner, men etter eksponering for UV lys-"photoconversion"-dens eksitasjon / emisjonsegenskapene blir lik de røde fluorescerende proteiner ^23,27. Viktigere, vil nytt protein som produseres etter photoconversion ikke har de samme eksitasjon / emisjonsegenskaper som photoconverted protein, tillater frakobling av produksjon og klaring ved photoconversion og observasjon av bare en pool av photoconverted protein. Tagging proteiner av interesse med photoconvertible proteiner gir dermed en praktisk måte å pulsere-label proteiner i intakte, optisk tilgjengelige levende organismer.

I FDAP analyser (Figur 1a), er et protein av interesse merket med en photoconvertible protein og uttrykkes i en levende organisme (figur 1B). Fusjonsproteinet photoconverted, og nedgangen i photoconverted signal over tid overvåkes av fluorescence mikroskopi (figur 1C). Dataene blir deretter utstyrt med en egnet modell for å bestemme halveringstiden til fusjonsproteinet (figur 1D).

Den FDAP analysen beskrevet her er designet for å bestemme de ekstracellulære halveringstider på utskilles signalanlegg proteiner i sebrafisk embryo under tidlig embryogenese ^19. Imidlertid kan denne tilnærmingen tilpasses enhver gjennomsiktig modell organisme som tåler direkte avbildning, og kan brukes til å overvåke clearance av noen taggable intracellulært eller ekstracellulært protein. Variasjoner av teknikken beskrevet her er utført i dyrkede celler ^20,23 og Drosophila ²² og mus ²¹ embryoer.

Protocol

1. Generere en Photoconvertible Fusion Konstruer og Injisering Dechorionated Sebrafisk embryo Generere en funksjonell konstruksjon inneholdende proteinet av interesse fusjonert til en grønn-til-rød photoconvertible protein (se Diskusjon), og deretter bruke in vitro transkripsjon for å generere avkortet mRNA som koder for fusjonsproteinet som i Muller et al., 2012 19. Bruk pronase for å fjerne chorions fra ca 30 sebrafisk embryoer ved en-cellestadiet….

Representative Results

FDAP har blitt brukt til å bestemme halveringstider på ekstracellulære signalproteiner i sebrafisk embryo 19. En av disse proteinene, myse, induserer uttrykk for mesendodermal gener under embryogenese 34. Myse-Dendra2 aktiverer uttrykk for mesendodermal gener på nivåer tilsvarende ukodet myse, som demonstrert av QRT-PCR og in situ hybridiseringsanalyser 19. Embryoene ble ko-injisert med Alexa488-dekstran og mRNA som koder for myse-Dendra2 og underkastet FDAP analysen. En re…

Discussion

Suksessen til en FDAP eksperiment er avhengig av dannelsen av en funksjonell photoconvertible fusjonsprotein. Tagging et protein kan påvirke sin biologiske aktivitet og / eller biofysiske egenskaper, herunder dets lokalisering, oppløselighet, og stabilitet ^36-41. Vær forberedt på å teste aktiviteten av flere ulike fusjonskonstruksjoner for å finne en som er aktiv. Vi har funnet at å endre posisjonen av photoconvertible protein i forhold til proteinet av interesse, eller ved å bruke lengre kopiere …

Materials

PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)			Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)			To generate capped mRNA for injection into embryos
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)			Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks
6-well plastic dish (BD Falcon)			Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting
Embryo medium			250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)			Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage
5 cm diameter glass petri dish			For embryo dechorionation
200 ml glass beaker			For embryo dechorionation
Microinjection apparatus			For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage
Stereomicroscope			For injecting and mounting embryos
1x Danieau's medium			Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2
UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)			For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use
Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)			For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos
Metal probe			For positioning embryos during mounting
Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)			Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5
15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium			For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette
Inverted laser scanning confocal microscope			A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required
Heated stage			To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment
Confocal software capable of time-lapse imaging			Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals
25x or 40x water objective			Objective for imaging
10x air objective			Objective for photoconversion
Immersion oil			Immersion oil with the same refractive index as water