Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Summary

Os níveis de proteína em células e tecidos são muitas vezes fortemente regulada pelo equilíbrio da produção de proteínas e de apuramento. Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), a cinética de apuramento de proteínas pode ser medida experimentalmente in vivo.

Abstract

A estabilidade da proteína influencia muitos aspectos da biologia, e medir a cinética limpeza de proteínas pode fornecer importantes insights sobre sistemas biológicos. Em experiências FDAP, o apuramento das proteínas nos organismos vivos podem ser medidos. Uma proteína de interesse é marcado com uma proteína fluorescente photoconvertible, expressa in vivo e photoconverted, e a diminuição do sinal photoconverted ao longo do tempo é monitorizada. Os dados são então equipado com um modelo de depuração adequada para determinar a meia-vida da proteína. Importante, a cinética de depuração de populações de proteína em diferentes compartimentos do organismo pode ser examinado separadamente aplicando máscaras compartimentais. Esta abordagem tem sido utilizada para determinar os intra- e extracelulares meias-vidas de proteínas de sinalização segregadas durante o desenvolvimento do peixe-zebra. Aqui, descrevemos um protocolo para experimentos FDAP em embriões de peixe-zebra. Deve ser possível usar FDAP para determinar a cinética de depuração dequalquer proteína de qualquer organismo taggable opticamente acessíveis.

Introduction

Os níveis de proteínas em células e organismos são determinados através das suas taxas de produção e de depuração. Proteína de semi-vida pode variar de minutos a dias ^1-4. Em muitos sistemas biológicos, a estabilização ou limpeza de proteínas-chave tem efeitos importantes sobre a atividade celular. Modulação da estabilidade da proteína intracelular é necessário para a progressão do ciclo celular ^5,6, sinalização de desenvolvimento ^7-9, apoptose ^10, e a função normal e manutenção de neurónios ^11,12. A estabilidade da proteína extracelular afecta a distribuição e disponibilidade de proteínas segregadas, tais como morfogénios ^13,14, dentro de um tecido.

Ao longo das últimas décadas, a estabilidade da proteína foi avaliado principalmente em cultura de células usando radioativo pulso de rotulagem ou experiências de perseguição cicloheximida ^15. Nesses experimentos pulse-chase, as células são transitoriamente ou expostos a um "pulso" de amino radioativoprecursores de ácidos que são incorporados em proteínas sintetizadas de novo, ou eles são expostos a ciclo-heximida, a qual inibe a síntese proteica. As células em cultura são então recolhidos em diferentes pontos de tempo, e, ou imunoprecipitação seguido por autorradiografia (em experiências de pulse-chase radioactivos) ou imunodetecção (em experiências de cicloheximida) é utilizada para quantificar a depuração de proteína ao longo do tempo.

Ensaios de estabilidade proteína convencionais têm várias deficiências. Primeiro, as proteínas nestes ensaios frequentemente não são expressos nos seus ambientes endógenos, mas sim em cultura de tecidos e por vezes em células a partir de espécies diferentes. Para proteínas cuja estabilidade é dependente do contexto, esta abordagem é problemática. Em segundo lugar, não é possível seguir a depuração de proteínas em células individuais ou organismos ao longo do tempo, e os dados obtidos nestes ensaios reflecte uma média de diferentes populações de células em diferentes pontos de tempo. Como as células individuais podem ter começadocom diferentes quantidades de proteína, pode ter retomado o marcador radioactivo ou cycloheximide em momentos diferentes, ou podem ter diferentes cinética de depuração, tais dados agregados pode ser enganador. Finalmente, no caso das experiências de perseguição cicloheximida, adição do inibidor da síntese de proteína pode ter efeitos fisiológicos não desejadas que podem alterar a estabilidade da proteína ^16-18 artificialmente. Estas deficiências podem ser evitadas através do uso de fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), uma técnica que utiliza proteínas photoconvertible para medir folga proteína dinamicamente nos organismos vivos ^19-25 (ver discussão para limitações da técnica FDAP).

Photoconvertible proteínas são proteínas fluorescentes cuja excitação e emissão propriedades mudam após exposição a determinados comprimentos de onda de luz ^26. Uma variante comumente usado é Dendra2, uma proteína photoconvertible "verde-to-vermelho", que tem inicialmente excitação de emissão e propriedades semelhantes às proteínas fluorescentes verdes, mas após a exposição à radiação UV luz- "fotoconversão" -sua excitação / emissão de propriedades tornam-se semelhantes às das proteínas fluorescentes vermelhas ^23,27. Importante, nova proteína produzida após fotoconversão não têm as mesmas propriedades de excitação / emissão como a proteína photoconverted, permitindo a dissociação da produção de depuração e em cima fotoconversão e observação de apenas um conjunto de proteínas photoconverted. Marcação de proteínas de interesse com proteínas photoconvertible, portanto, fornece uma maneira conveniente de pulso de rótulo proteínas intactas, organismos vivos opticamente acessíveis.

Em ensaios FDAP (Figura 1A), uma proteína de interesse é marcado com uma proteína photoconvertible e expressa num organismo vivo (Figura 1B). A proteína de fusão é photoconverted, e a diminuição do sinal de photoconverted ao longo do tempo é monitorizado por fluorescenmicroscopia ce (Figura 1C). Os dados são então montados com um modelo apropriado para determinar a meia-vida da proteína de fusão (Figura 1D).

O ensaio aqui descrito FDAP foi desenhado para determinar as semividas extracelulares de proteínas de sinalização segregadas em embriões de peixe-zebra durante a embriogénese precoce ^19. No entanto, esta abordagem pode ser adaptada para qualquer organismo modelo transparente que tolera imagens ao vivo, e pode ser utilizado para monitorar a depuração de qualquer proteína intracelular ou extracelular taggable. As variações da técnica aqui descrita não tem sido realizada em células em cultura e ^20,23 Drosophila ²² e ²¹ embriões de ratinho.

Protocol

1. Gerando um Photoconvertible construção de fusão e injetando dechorionated embriões Zebrafish Gerar uma construção funcional contendo a proteína de interesse fundida com uma proteína photoconvertible verde-a-vermelho (ver discussão), em seguida, utilizar a transcrição in vitro para gerar ARNm que codifica tapado a proteína de fusão como em Muller et al., 2012 19. Use pronase para remover os córions de cerca de 30 embriões de pei…

Representative Results

FDAP tem sido usado para determinar a meia-vida de proteínas de sinalização extracelular em embriões de peixe-zebra 19. Uma destas proteínas, estrabismo, induz a expressão de genes durante o desenvolvimento embrionário mesendodermal 34. Estrabismo-Dendra2 activa a expressão de genes mesendodermal em níveis semelhantes aos estrabismo não marcado, como demonstrado por qRT-PCR e hibridização in situ em 19 ensaios. Os embriões foram co-injectados com Alexa488-dextrano e…

Discussion

O sucesso de uma experiência FDAP baseia-se na geração de uma proteína de fusão photoconvertible funcional. Marcação de uma proteína pode afectar a sua actividade biológica e / ou propriedades biofísicas, incluindo a sua localização, a solubilidade, a estabilidade e ^36-41. Ser preparados para testar a actividade de várias construções de fusão diferentes, a fim de encontrar um que seja activo. Verificou-se que a mudança da posição da proteína photoconvertible em relação à proteína de in…

Materials

PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)			Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)			To generate capped mRNA for injection into embryos
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)			Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks
6-well plastic dish (BD Falcon)			Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting
Embryo medium			250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)			Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage
5 cm diameter glass petri dish			For embryo dechorionation
200 ml glass beaker			For embryo dechorionation
Microinjection apparatus			For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage
Stereomicroscope			For injecting and mounting embryos
1x Danieau's medium			Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2
UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)			For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use
Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)			For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos
Metal probe			For positioning embryos during mounting
Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)			Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5
15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium			For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette
Inverted laser scanning confocal microscope			A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required
Heated stage			To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment
Confocal software capable of time-lapse imaging			Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals
25x or 40x water objective			Objective for imaging
10x air objective			Objective for photoconversion
Immersion oil			Immersion oil with the same refractive index as water