Mätning Protein Stabilitet i Living Zebrafish embryon Använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP)

Summary

Protein nivåer i celler och vävnader är ofta hårt reglerad av balansen mellan produktionen och clearance-protein. Använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP), kan släppnings kinetiken av proteiner experimentellt mätas in vivo.

Abstract

Protein stabilitet påverkar många aspekter av biologi och mäta klare kinetik proteiner kan ge viktiga insikter i biologiska system. I FDAP experiment, kan clearance av proteiner inom levande organismer mätas. Ett protein av intresse är märkt med ett photoconvertible fluorescerande protein, uttryckt in vivo och photoconverted, och minskningen i den photoconverted signalen över tiden övervakas. Data sedan utrustad med en lämplig clearancemodellen att bestämma protein halveringstid. Viktigt kan clearance kinetiken av proteinpopulationer i olika fack i organismen undersökas separat genom att tillämpa kompartment-masker. Detta tillvägagångssätt har använts för att bestämma de intra- och extracellulära halveringstider utsöndrade signalproteiner under zebrafisk utveckling. Här beskriver vi ett protokoll för FDAP experiment i zebrafiskembryon. Det bör vara möjligt att använda FDAP att bestämma clearance skinetiken förvarje märkningsbara protein i någon optiskt åtkomlig organism.

Introduction

Nivåerna av proteiner i celler och organismer bestäms av deras produktionshastigheter och clearance. Proteinhalveringstider kan variera från minuter till dagar ^1-4. I många biologiska system, stabilisering eller clearance av nyckelproteiner har viktiga effekter på cellulär aktivitet. Modulering av intracellulär proteinstabilitet krävs för cellcykelprogression ^5,6, utvecklings signalering ^7-9, apoptos ^10, och normal funktion och underhåll av nervceller ^11,12. Extracellulär proteinstabilitet påverkar fördelningen och tillgången av utsöndrade proteiner, såsom morfogener ^13,14, i en vävnad.

Under de senaste decennierna har proteinstabilitet främst bedömts i cellkultur med hjälp radioaktiv puls-märkning eller cykloheximid chase experiment ^15. I sådana puls chase experiment, celler antingen transient utsatt för en "puls" av radioaktivt aminosyraprekursorer som införlivas i nysyntetiserade proteiner, eller de är utsatta för cykloheximid, som inhiberar proteinsyntes. Odlade celler samlas sedan vid olika tidpunkter, och antingen immunoprecipitation följt av autoradiografi (i radioaktiva puls chase experiment) eller western blotting (i cykloheximid experiment) används för att kvantifiera clearance av proteinet över tid.

Konventionella proteinstabilitetsanalyser har flera brister. Först, är proteiner i dessa analyser ofta inte uttryckta i sina endogena miljöer, utan snarare i vävnadskultur och ibland i celler från olika arter. För proteiner vars stabilitet är kontextberoende, är detta synsätt problematisk. För det andra är det inte möjligt att följa proteinet clearance i enskilda celler eller organismer över tiden, och data från dessa analyser avspeglar ett genomsnitt av olika populationer av celler vid olika tidpunkter. Eftersom enskilda celler kan ha börjatmed olika mängder protein, kan ha tagit upp den radioaktiva märkningen eller cykloheximid vid olika tidpunkter, eller kan ha olika clearance kinetik, sådana aggregerade data kan vara missvisande. Slutligen när det gäller cykloheximid chase experiment, kan tillsats av proteinsynteshämmare har oavsiktliga fysiologiska effekter som på konstgjord väg kunde ändra proteinstabilitet ^16-18. Dessa brister kan undvikas genom att använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP), en teknik som utnyttjar photoconvertible proteiner för att mäta protein clearance dynamiskt i levande organismer ^19-25 (se diskussion om begränsningar av FDAP tekniken).

Photoconvertible proteiner är fluorescerande proteiner vars excitation och emissionsegenskaper förändras efter exponering för specifika våglängder av ljus ^26. En vanligt använd variant är Dendra2, en "grön-till-röda" photoconvertible protein som initialt har excitation och emissionsegenskaper liknande gröna fluorescerande proteiner, men efter exponering för UV-ljus- "photoconversion" -dess excitation / emissionsegenskaper blir liknar dem hos röda fluorescerande proteiner ^23,27. Viktigt kommer nya protein som produceras efter photoconversion inte samma excitation / emissionsegenskaper som photoconverted protein, vilket gör frikoppling av produktion och avslut på photoconversion och observation av endast en pool av photoconverted protein. Märka proteiner av intresse med photoconvertible proteiner ger därmed ett bekvämt sätt att pulsmärkes proteiner i intakta, optiskt åtkomliga levande organismer.

I FDAP analyser (Figur 1A), är ett protein av intresse taggade med photoconvertible protein och uttrycks i en levande organism (Figur 1B). Fusionsproteinet photoconverted, och minskningen i photoconverted signalen över tiden övervakas av fluorescence mikroskopi (Figur 1C). Uppgifterna är sedan försedd med en lämplig modell för att bestämma halveringstiden för fusionsproteinet (figur 1D).

Den FDAP analys som beskrivs här var utformad för att bestämma de extracellulära halveringstider på utsöndrade signalproteiner i zebrafisk embryon under tidig embryogenes ^19. Däremot kan anpassas denna inställning till något transparent modellorganism som tål levande avbildning, och kan användas för att övervaka clearance av varje märkningsbara intracellulär eller extracellulär protein. Variationer av den teknik som beskrivs här har utförts i odlade celler ^20,23 och Drosophila ²² och mus ²¹ embryon.

Protocol

1. Generera en Photoconvertible Fusion Konstruera och injektion dechorionated Zebrafish embryon Generera en funktionell konstruktion innehållande proteinet av intresse smält till en grön-till-röd photoconvertible protein (se Diskussion), sedan använda in vitro-transkription för att generera capped mRNA som kodar för fusionsproteinet som i Muller et al., 2012 19. Använd pronas att ta bort chorions från cirka 30 zebrafisk embryon vid en cellstadie…

Representative Results

FDAP har använts för att bestämma de halveringstider av extracellulära signalerande proteiner i zebrafiskembryon 19. En av dessa proteiner, kisa, inducerar uttryck av mesendodermal gener under foster 34. Kisa-Dendra2 aktiverar uttryck av mesendodermal gener på nivåer som liknar otaggad Squint, vilket framgår av QRT-PCR och in situ hybridisering analyser 19. Embryon samar injicerades med Alexa488-dextran och mRNA som kodar Squint-Dendra2 och utsattes för FDAP analysen. En…

Discussion

Framgången för en FDAP experiment bygger på alstringen av en funktionell photoconvertible fusionsprotein. Märka ett protein kan påverka dess biologiska aktivitet och / eller biofysiska egenskaper, inklusive dess lokalisering, löslighet och stabilitet ^36-41. Var beredd på att testa aktiviteten av flera olika fusionskonstruktioner för att hitta en som är aktiv. Vi har funnit att ändra läget på den photoconvertible proteinet i förhållande till proteinet av intresse eller användning av längre link…

Materials

PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)			Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)			To generate capped mRNA for injection into embryos
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)			Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks
6-well plastic dish (BD Falcon)			Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting
Embryo medium			250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)			Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage
5 cm diameter glass petri dish			For embryo dechorionation
200 ml glass beaker			For embryo dechorionation
Microinjection apparatus			For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage
Stereomicroscope			For injecting and mounting embryos
1x Danieau's medium			Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2
UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)			For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use
Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)			For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos
Metal probe			For positioning embryos during mounting
Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)			Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5
15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium			For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette
Inverted laser scanning confocal microscope			A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required
Heated stage			To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment
Confocal software capable of time-lapse imaging			Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals
25x or 40x water objective			Objective for imaging
10x air objective			Objective for photoconversion
Immersion oil			Immersion oil with the same refractive index as water