electroformation ve jel destekli şişme – dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.
Dev lamelli kesecikler (GUVs) membran ilişkili olayları incelemek için popüler bir biomimetic sistemi vardır. Ancak, genel olarak GUVs fonksiyonel transmembran proteinleri içeren GUVs oluşturmak üzere tadil edilmesi gerekmektedir büyümeye protokolleridir. Electroformation ve jel destekli şişme – – voltaj-kapılı potasyum kanalı, KvAP içeren GUVs oluşturmak için Bu makalede, iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri açıklanmaktadır. Her iki yöntemde de, protein ihtiva eden küçük tek lamelli vesiküller bir çözeltisi daha sonra bir rehidrasyon tamponu içinde şişmeye bırakıldı membran bir yığın oluşturmak üzere kısmen dehidre edilmiştir. AC alanı film rehidrasyon esnasında uygulanabilir ve böylece electroformation yöntemi için, film, platin elektrot üzerine bırakılır. Bunun tersine, jel destekli şişme yöntem filmi rehidrasyon geliştirmek üzere bir agaroz jel alt tabakayı kullanır. Her iki yöntem de (örneğin, 5 mM) ile, düşük ve fizyolojik (örneğin, 100 mM) tuzu konsantrasyonlarında GUVs üretebilir. Elde GUVs floresan mikroskobu ile karakterize edilir ve yeniden kanalların fonksiyonu iç-dış yama-kelepçe yapılandırmayı kullanarak ölçtü. Alternatif elektrik alanı (electroformation) mevcudiyetinde şişen hatasız GUVs yüksek bir verim sağladığını birlikte, jel destekli şişme yöntem daha homojen bir protein dağılımı sağlar ve herhangi bir özel ekipman gerektirir.
Canlı sistemleri yöneten fiziksel ilkeleri incelerken, aşağıdan yukarıya yaklaşımlar bir Deneyciler sistemi kompozisyon ve kolayca hücre tabanlı sistemler 1 manipüle olmayan diğer parametreleri kontrol etmenizi sağlar. 10 – bunlar mikroskop çalışmaları ve mikromanüplasyon 8 için uygun olarak 7 – membran bazlı işlemler için, Dev tek katmanlı veziküller (GUVs, çap ~ 1-100 um) çok yararlı biomimetik sistemi 2 olduğu kanıtlanmıştır. GUVs üretmek için birçok farklı protokoller olmakla birlikte, en fazla iki kategoriye ayrılır – 16 – bazlı emülsiyon, bir lipit filme 13 rehidrasyon dayalı 11,12 ve teknikleri yaklaşır. Emülsiyon bazlı yöntemlerde, GUV membran iç ve dış bildiriler su / yağ ara yüzlerinde lipit mono tabakaları arka arkaya monte edilir. Bu yaklaşım ile çözülebilir proteinlerin kapsüllenmesinde için idealdirGUVs olarak ve asimetrik yaprakçık lipit bileşimiyle GUVs oluşturulması için. Bununla birlikte, emülsiyonlar meydana GUVs zarın mekanik özellikleri 17 değiştirmek çözücünün izlerini tutabilen ve bu yaklaşım, trans-membran proteini yeniden için özellikle çok uygundur değildir.
Film rehidrasyon yöntemleri (dehidratasyon), kurutma zarların çoklu katmanlı yığını oluşturmak için birçok lipit karışımları neden olduğu gerçeğine dayanır. Bu yığın daha sonra sulu bir tampon maddesi ile temas içinde yerleştirilir, yığındaki membranlar aralarında ve yığın yüzeyinde ayrı çözücü akışı hareket eder, ayrı ayrı membranlar GUVs 13,18 (aynı zamanda, gerçek bir hayvanat bahçesi oluşturmak üzere ayırabilirisiniz Diğer lipidik nesneler). Bununla birlikte, daha iyi bir tampon ve lipid bileşimleri için, bu klasik "kendiliğinden şişme" yöntemi hatasız GUVs nispeten düşük bir verime sahiptir. Hatasız GUVs verimini artırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir "electroformation olduğunuBir alternatif akım (AC) alanı film rehidrasyon esnasında uygulandığı 221 ;,. Mekanizma henüz tam olarak anlaşılamamış olsa da, "electroformation" Muhteşem GUV verimleri verebilir (> olumlu koşullarda% 90), düşük tuz konsantrasyonu tamponlar için (<5 mM) 14,19, ve hatta (~ 100 mM) fizyolojik tamponlar çalışabilir kullanarak bir yüksek frekans (10 Hz karşı 500 Hz), AC alanı ve platin elektrotları 15. Hatasız GUVs verimini artırmak için alternatif bir yaklaşım, lipid çözeltisi (örneğin, cam, PTFE), alt-tabakalar, klasik "bir anda şişme kullanılan pasif değil, bir polimerik jel alt-tabaka üzerine biriktirilmektedir," jel destekli şişme "bir ". Elde edilen yağ / jel ince tabaka rehidrate zaman, GUVs bile hızlı bir fizyolojik tampon 16,20 için oluşabilir.
Tüm bu yöntemler, örneğin zara bağlı olayları incelemek için kullanılabilir lipid tek GUVs üretebilirçözünür proteinler ve zarlar arasındaki etkileşimi kapsamaktadır. Bununla birlikte, GUVs bir trans-membran proteini birleştirmek için önemli değişiklikler proteinin yeniden oluşturma işlemi boyunca işlevsel bir durumda kalmasını sağlamak için gereklidir. Organik çözücüler (örneğin kloroform, sikloheksan) lipidlerin çözeltileri lipit film üretmek için idealdir birlikte, hidrofobik zar-ötesi domeni bir lipid iki-tabaka içinde gömülü ya da bir deterjan misel içine alındığında, trans-membran proteinleri tipik olarak, sadece kararlı olan ( Örneğin, protein saflaştırma sırasında). Bu nedenle, bir yeniden başlangıç malzemesi tipik olarak deterjan çıkarılmasıyla oluşan doğal membran, bir deterjan çözeltisi içinde saflaştırılmış proteini ya da küçük tek lamelli protein içeren veziküller (proteolitik-SUV) ve / veya çok-lamelli veziküller (proteolitik-MLV'ler) 'dir lipidlerin mevcudiyeti. GUVs içine bu zar proteinleri dahil çoğu yöntemleri üç kategoriye ayrılır.
Doğrudan insertioN: deterjan içinde süspansiyon haline trans-membran proteini önceden oluşturulmuş, lipid sadece hafif deterjan çözündürülmüş GUVs ile karıştırılır ve daha sonra deterjan Biobeads 21 kullanılarak kaldırılır. Kavramsal olarak basit olmakla birlikte, bu yöntem çok yüksek bir deterjan konsantrasyonunun bir konsantrasyon proteini açığa veya agregat neden olabilir çok düşük ise GUVs eritmesi olarak, deterjan konsantrasyonunun hassas kontrolünü gerektirir.
GUV / Proteo SUV Füzyon: proteolitik-SUV Protein, önceden oluşturulmuş, lipid sadece GUVs ile birleştirilir ve füzyon özel füzyojenik peptidler 22 veya deterjan 21 ile kolaylaştırılır. Tipik füzyon ölçüde düşük protein yoğunluğu ile GUVs lider kısıtlıdır.
Dehidrasyon / Rehidrasyon: bir protein ihtiva eden lipid filmi kısmi bir proteolitik-SUV dehidrasyon (ya da proteolitik-MLV) çözeltisi ve GUVs oluşturduğu sonra saf bir lipit film için büyütülür. bariz zorluk kısmi dehydrati sırasında protein korumak25 – Adım 23, ancak yöntemi başarılı bir şekilde GUVs 7,23 içine örneğin bakteriyorodopsin, Kalsiyum-ATPaz, integrin ve SSVD'de trans-membran proteinleri oluşturmak için kullanılan edilmiştir.
Bu makalede, hiper-termofilik Archaea, Aeropyrum pernix voltaj kapılı potasyum kanal KvAP içeren GUVs için dehidratasyon / rehidrasyon protokollerini tasvir eder. KvAP ökaryotik voltaja bağımlı potasyum kanalları 26 homoloji derecesi yüksek ve bilinen bir kristal yapıya sahip olan 27 , gerilim yolluk mekanizması okuyan için iyi bir modeli yapma. Proteolitik-SUV üretimi, daha önce detaylı bir şekilde tarif edilmiş ve bu yazının 26,28,29 bir parçası değildir edilmiştir. Önemli olarak, KvAP proteolitik-SUV da uzun bir süre (> 1 yıl), -80 ° C'de küçük (örneğin, 10 ul) bölümler halinde saklanabilir gibi her GUV hazırlanması için imal edilmesi gerekmez. Electroformationya da jel destekli şişme sonra KvAP proteolitik-SUV'lerden GUVs büyütmek için kullanılan (ya da proteolitik-MLV'ler) olabilir.
electroformation protokolü için temel aşamalar, Şekil 1 'de tasvir edilmiştir. Protein içeren SUV solüsyonu damlalar (Şekil 2'de gösterilmiştir) platin tellerden birikirler. SUV süspansiyonun kısmi dehidrasyon SUV füzyon yoluyla bir lipit, protein film tabakasının oluşmasına neden olur. Rehidrasyon esnasında, bir AC alanı GUVs delamine oluşturmak üzere, lipid tabakaları yardımcı olmak için elektrotlara uygulanır. "Düşük tuz" kullanılırken 10 Hz alanı iyi çalışıyor (<5 mM) rehidrasyon tampon 28 ve GUVs birkaç saat sürebilir büyümeye. Buna karşılık, fizyolojik tamponlar düşük gerilim, 500 Hz AC alanı ile iyi çalışır, ancak gerektirir (tuz ~ 100 mM içeren) bir uzun (~ 12 saat) dönemi 15 şişlik. Bu yöntem İTO 24 slaytlar kullanarak bir önceki protokol dayalı, ama özel bir odası cont kullanırŞekil 2'de görüldüğü gibi iki platin tel, geri kalan (basit tasarım detayları ve önerileriniz için tartışma bakın, odaları doğaçlama).
Şekil 3, jel destekli şişme yöntemi göstermektedir. Protokol, fizyolojik tuz konsantrasyonlarına sahip tampon maddeler ile iyi çalışır hızlı ve daha homojen olan bir protein dağılımı GUVs üretir. Ancak, izole, görünüşe göre hatasız GUVs verimi (yani, GUV membran üniforma optik uzunluk-ölçeklerde ve herhangi bir nesne içine değil) bu yama-kelepçe ve mikro-manipülasyon deneyler için yeterli sayıda sağlamasına rağmen, düşük . Bu yöntem, lipid sadece GUVs 16 üretmek electroformation yöntemine göre daha az özel ekipman gerektirir agaroz jel kullanılarak bir protokole dayanmaktadır.
floresan mikroskobu ile GUVs karakterizasyonu standart yama-kelepçe set-up kullanarak prosedürler yanı sıra, açıklanan"inside-out" in KvAP aktivitesini ölçmek membran yamaları çıkarıldı.
Büyüyen protein ihtiva eden GUVs lipid tek GUVs daha zor olabilir. Özellikle, son GUV verimi membran yığını oluşturmak için tam olarak nasıl SUV çözümü yatırılır ve susuz üzerinde hassas güvenebilirsiniz. GUVs herhangi bir önceki deneyim, bir kimse için, ilk membran film, organik bir çözücü lipitleri biriktirilmesiyle oluşturulduğu bilinen bir protokol 15,16 aşağıdaki lipid tek GUVs büyümeye yardımcı olabilir. Geleneksel protokol iyi çalışıyor sonra, SUV biriktirme ve kısmi dehidratasyon sonra yeni bir lipit kompozisyonu için protokol ayarlarken de çok yararlı olan lipit sadece SUV'lar kullanılarak hakim olabilir. GUVs lipid tek SUV ile ilgili güvenilir büyüdüklerinde, bu proteolitik-SUV protein ihtiva eden GUVs üretmek için sadece küçük bir adım daha sonra.
Biomimetic model sistemler, protein ve membran özellikleri ve etkileşimler üzerinde çalışmak için önemli bir araçtır. BLMs veya desteklenen lipid zarlar gibi diğer sulandırılmış sistemlerle karşılaştırıldığında, GUV sistemlerini önemli membran bileşimi, gerilim ve geometri kontrolü yanı sıra gerçekten olmanın petrol-ücretsiz dahil olmak üzere mevcut birçok fırsatlar tabanlı. Bununla birlikte, GUVs içine, örneğin KvAP transmembran proteinleri içeren lipid sadece GUVs için bilinen p…
The authors have nothing to disclose.
We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).
Name of the Material/Equipment |
Company | Catalog Number | Comments/ Description |
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
Amber vials and teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
Parafilm | VWR | 291-1214 | |
microcentrifuge tube | eppendorf | diverse | |
Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
KCl | Sigma | P9333-1kg | |
Hepes | Sigma | H3375-100G | |
TRIS | Euromex | EU0011-A | |
Osmometer | Wescor | Vapro | |
pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
Syringe filter 0.2µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
Function generator | TTi | TG315 | |
Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d=0.5mm |
Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
Cover slides 22×40 mm No1,5 | VWR | 631-0136 | |
Cover slides 22×22 mm No1,5 | VWR | 631-0125 | |
plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cmx1cm |
patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
Labview | National Instruments | version 8.6 | |
Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
pipette puller | Sutter | P-2000 | |
Camera | ProSilica | GC1380 | |
Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
Objective | Zeiss | 40x long working distance, Phase contrast | |
Objective | Zeiss | 100x Plan-Apochromat NA 1.3 | |
Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
Objective | Nikon | Plan Fluor 100× NA1.3 | |
matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |