הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Summary

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Abstract

רגולציה של סינתזת חלבון מהווה נקודת שליטה מרכזית בתגובה תאית ללחץ. בפרט, יחידות בקרת RNA דיסקרטי הוצגו כדי לאפשר לתרגום סלקטיבי של mRNAs הספציפי, אשר בדרך כלל קשורים לחלבונים הנדרשים לתגובת לחץ מסוימת. זיהוי של mRNAs אלה, כמו גם האפיון של מנגנוני פיקוח אחראים לתרגום סלקטיבי היה בחוד החנית של ביולוגיה מולקולרית לכמה זמן. פרופיל Polysome הוא שיטת אבן פינה במחקרים אלה. המטרה של פרופיל polysome היא ללכוד תרגום mRNA על ידי משתק ריבוזומים פעיל תרגום בתמלילים שונים ונפרדת polyribosomes וכתוצאה מכך על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז, ובכך מאפשר להבחנה בין תמלילים מתורגמים ביותר ואלה תורגמו בצורה גרועה. אז יכולות להיות מאופיינות אלה נוספות על ידי שיטות ביולוגיה מולקולריות ביוכימי ומסורתית. חשוב לציין, עמ 'שילובolysome פרופיל עם גישות הגנומי תפוקה גבוהה מאפשר ניתוח בקנה מידה גדול של הרגולציה translational.

Introduction

רגולציה של סינתזת חלבון (תרגום) היא תהליך תאי חשוב שקשורה קשר הדוק להישרדות סלולרית. בהתחשב בעובדה שהתרגום צורך יותר מ -50% מהאנרגיה של התא, אין זה מפתיע שהתרגום מוסדר בחוזקה ושההפרעות בתרגום אינן נסבלות היטב. לעומת זאת, רבים תהליכים תאיים חריגים דורשים כי מכונות תרגום ופלט תרגום (כלומר proteome) צריכים להיות שונה. זה קורה לעתים קרובות במדינות תגובת לחץ ומחלות שונות, והוא כנראה הכי טוב שהודגם בסרטן. יתרון מפתח של שליטת translational הוא היכולת של תאים לתכנת מחדש במהירות את תפוקת החלבון בתגובה לטריגרים חיצוניים ופנימיים שונים, מנגנון כוונון ובכך בסדר שעצות האיזון בין הישרדות תא ומות ^1.

שני היבטים של שליטת translational מעניינים במיוחד; הבנה של הטבע של MEC הרגולציהאלמנטי hanism (ים) ובקרה המאפשרים לתרגום ספציפי, וזיהוי של mRNAs הספציפי ומוצרי החלבון שלהם, המשתתפים בתגובה התאית להדק המסוים שעורר תרגום סלקטיבי במקום הראשון. פרופיל Polysome הוא טכניקה המאפשרת לימוד אפקטיבי של שני התהליכים.

המטרה הכללית של טכניקת פרופיל polysome היא ללמוד ולכמת את מצב התרגום של mRNAs המסוים בתנאים סלולריים שונים. העיקרון של השיטה הוא ללכוד תרגום mRNA על ידי '' הקפאה '' ריבוזומים פעילים תרגום בתמלילים שונים ונפרדים polyribosomes וכתוצאה מכך על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז, ובכך מאפשרים להבחנה בין תמלילים מתורגמים ביותר (מחויבת כמה ריבוזומים) ו גרוע מתורגם אלה (כפופים לריבוזומים אחד או שניים). בפרוטוקול ספציפי זה, cycloheximide האנטיביוטי שנקשר ל60S מקטע ריבוזומלי וחוסם את שחרורו של tRNA deacetylated מאתר E הריבוזום ^2, משמש כדי לעכב טרנסלוקציה הריבוזום ולעכב ריבוזומים על mRNAs תרגום. עם זאת, סוכני חסימה אחרים כגון emetine שתרגום גם חוסם התארכות ^3, ניתן להשתמש.

בניגוד למערבי סופג ו ^-35 S-מתיונין טכניקות תיוג המודדות את התוצר הסופי של תהליך התרגום, polysome יש פרופיל את היתרון של מדידת עמותת ריבוזומים עם mRNAs באופן פעיל-המתורגם, ובכך מאפשר למחקר מפורט יותר של מנגנוני תרגום בתנאים שונים. לפיכך, הטכניקה ניתן להתאים בקלות ללמוד במיוחד מצבים שונים של תרגום ^4-6, גורמי חלבונים מעורבים בויסות תרגום ^7-9, תנאי לחץ משפיעים על סינתזת חלבון ^1,10,11 או את ההשפעות של מבני mRNA כגון IRES או במעלה הזרם מסגרות קריאה פתוחות בסינטיסייזר החלבוןesis ^12-14. כיום, polysome יישומי פרופיל הם אפילו רחבים יותר בשימוש במערכים DNA ¹⁵ או רצף של הדור הבא ^16,17 לנתח mRNAs הקשורים polysomes.

Protocol

הערה: הערה על עבודה עם RNA: היזהר בתקן להגנה מפני השפלה RNA על ידי RNases. השתמש בכפפות, טיפים פיפטה המחסום, plasticware RNase ללא וכימיקלים בכל השלבים של הפרוטוקול. השתמש ultrapure או מים שטופל DEPC לכל הפתרונות. לטהר כל משטחים חשודים עם פתרון איון RNase בעקבות הפרוטוקול של היצרן. 1. הכנה של פתרונות. להכין 500 מיליליטר של יסוד הפתרון (0.3 M NaCl;. 15 מ"מ MgCl 2 6 שעות 2 O; 15 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4). מערבבים בעזרת סרגל ומערבבים עד הפתרון הוא ברור ועובר דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. אחסן בטמפרטורת חדר. הכן 10 ו 50% פתרונות סוכרוז ו 60% פתרון צ'ייס כדלקמן: 10% סוכרוז פתרון (w / v), בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר להוסיף 5 סוכרוז g ולמלא 50 מיליליטר עם יסוד פתרון. עבור 50% סוכרוז פתרון (w / v), במודעת צינור צנטריפוגה 50 מיליליטרד 25 סוכרוז g ולמלא 50 מיליליטר עם יסוד פתרון. עבור 60% (w / v) צ'ייס פתרון, בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר להוסיף 30 סוכרוז g ולמלא 50 מיליליטר עם יסוד פתרון. הוספה של פתרון הכחול bromophenol רווי 100 μl (להוסיף bromophenol הכחול למים עד שלא יותר יתמוסס; צנטריפוגות כדי גלולה האבקה שלא נמסה) לפתרון מרדף 60%. מערבבים בעזרת מערבולת ולאמת פירוק מוחלט. פתרונות חנות ב 4 ° C עד צורך. הכן RNA תמוגה חיץ. הכן חיץ זה טרי ביום של הניסוי. הכן 500 μl של חיץ תמוגה RNA עבור כל דגימה. ל 1 מיליליטר של יסוד פתרון להוסיף 10 μl טריטון X-100 (1% [v / v] סופי), μl 1 של 100 מ"ג / מיליליטר cycloheximide בDMSO (CHX, 0.1 מ"ג / מיליליטר סופי) ו -3.5 RNasin μl (140 U / Ml). מערבבים בעזרת מערבולת. שמור על קרח. הערה: cycloheximide הוא רעיל ביותר ועלולה לגרום למוטציות. הימנע ממגע עם עור ושאיפה. כדי להימנע מטיפול בצורת האבקה לעתים קרובות מדי, הכנההם כמות גדולה יותר של 100 מ"ג / מיליליטר מניות בDMSO, aliquot ולשמור ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. להמשיך לעבוד המניה ב -20 מעלות צלזיוס. היום של הניסוי, להכין פתרונות סוכרוז + CHX על ידי הוספת CHX (ריכוז סופי של 0.1 מ"ג / מיליליטר) להיקף הרצוי של 10% ו -50% תמיסת סוכרוז (~ 7 מיליליטר של כל פתרון לשיפוע). 2. הכנת סוכרוז Gradient שימוש להכנת אוטומטית של צבע הפעל יצרנית השיפוע '' על '' ואת רמת הצלחת שתחזיק הדרגתיים (criticalstep!) לחץ על '' הסיום '' כאשר צלחת מפולסת. בחר בתפריט תכנית השיפוע שיופעל: לחץ על תפריט '' גראד '' ובחר '' רשימה ''. בחר באפשרות "SW41". גלול ברשימה ובחר את תכנית "על ידי עיתונות" '10 – 11 צעדים – השיפוע של 50% "ing על הכפתור '' תרוץ ''. הנח צינור חרוטי ultracentrifuge (SW-41 צינור, 14 x 89 מ"מ) לבלוק מרקר ולהשתמש בסמן צינור הקנס קבוע לאתר את חותמו על הצינור לאורך המדרגה העליונה של בלוק דה מרקר. מניחים צינורות במעמד הולם על משטח יציב. הערה: סימון זה יהיה מדריך המילוי לשכבות פתרונות סוכרוז 10 ו -50%. צרף את צינורית שני הניתנת לשני מזרקים 10 מיליליטר ולשטוף על ידי pipetting למעלה ולמטה עם מים חמים מזוקקים המכילים פתרון איון RNase. הקפד להסיר את כל העקבות של מים לאחר מכן. מלא את אחד מהמזרקים עם 10% CHX + סוכרוז והכנס את הצינורית בחלק התחתון של צינור ultracentrifuge. בעדינות לוותר פתרון 10% סוכרוז עד שהולך רק בעבר הסימן שנעשה על הצינור. הערה: הימנע עושה בועות. אם בועות טופס, לטפוח בעדינות צינורית כדי לעקור אותם. מלא את המזרק האחר עם סוכרוז 50% + CHX, לנגב נוזלי נוספת מעם צינורית לנגב בעדינות להכניס בחלק התחתון של צינור ultracentrifuge. בעדינות לוותר תמיסת סוכרוז 50% עד שהוא מגיע בדיוק הסימן. במהירות ובצורה חלקה להסיר את הצינורית. הערה: סוכרוז 10% צריך לעלות בצינור ויוצר מיניסקוס בשטח. אם לא, להוסיף עוד תמיסת סוכרוז 10% על פני השטח. הכנס את הכובע הניתן על ידי הטיית צינור ultracentrifuge מעט ועקירת כל בועות האוויר. הסר נוזל עודף במאגר של הכובע עם micropipet. נגב נוזל עודף לאורך קיר הצינור ומניחים על צלחת יצרנית השיפוע. לחץ על הכפתור '' תרוץ ''. הערה: הצלחת להטות בזווית שצוינה, לעצור לשנייה 5 והסיבובים כדי ליצור השיפוע יתחיל. כאשר היווצרות שיפוע היא מלאה (כ 2 דקות, המכשיר ישמיע צפצוף), להסיר בעדינות את ultracentrifuge (ים), מקום על מדף ובמהירות להסיר את הכובע בתנועה כלפי מעלה כדי להימנע מלהפריע gradie NT. שמור שיפוע (ים) על קרח. נא לא להפריע! לחלופין, שיפועים לשמור לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס. לחלופין, להשתמש באמצעים לשיפוע שני קאמריים לעשות הדרגתיים כדלקמן: צינורות יש לשטוף ויצרנית שיפוע עם פתרון איון RNase ומים RNase חינם. הוסף 5 מיליליטר של סוכרוז 50% + CHX לתא הפרוקסימלי של יצרנית שיפוע ולהבטיח כי כל אוויר שבין שני התאים יוסר. הוסף 5 מיליליטר של סוכרוז 10% + CHX לתא הדיסטלי של יצרנית שיפוע. הוסף 0.5 מיליליטר של סוכרוז 50% + CHX לחלק תחתון של צינור צנטריפוגה חרוטי (צינור SW-41, 14 x 89 מ"מ) ומקום בבעל צינור. הפעל בוחש ממוקם בתא הפרוקסימלי, תחנה-זין פתוח והפקדת שיפוע במהירות מוגדרת "3" (כ 1 מ"ל / דק '). שיפוע מקום (ים) על קרח. נָא לֹא להַפרִיעַ. יכול להיות כל הזמן Gradients הלילה ב 4 מעלות צלזיוס: הערה. 3. תא תמוגה וultracentrifugation. <ol style="

Representative Results

יש לנו לאחרונה תיארתי תפקיד חדש למדכא גידול PDCD4 כמעכב תרגום סלקטיבי של IRES-מחסה mRNAs קידוד מעכבים אפופטוטיים XIAP וBcl-XL 12. פרופיל Polysome היה טכניקת מפתח כדי להדגים את המעורבות הספציפית של PDCD4 בתרגום תיווך IRES. HEK293 תאים היו transfected זמני לרוקן רמות אנדוגני של PDCD4 (איור 1 א), ואז העביר לpolysome ניתוח פרופיל. הבחנו כי רמות הפחתה של PDCD4 לא לפגוע בתרגום סלולארי הגלובלי, כמו להישפט על ידי חוסר השינויים בפרופיל polysome כאשר משווים siCTRL וsiPDCD4 תאים שטופלו (איור 1). באופן דומה, polysome הפצה של גרסה הלא-IRES של XIAP 19 הייתה ללא שינוי בין תאים שטופלו ולא טופלו (איור 1 ג '). בניגוד לכך, polysome הפצה של mRNAs שני IRES-מחסה, XIAP וBcl-XL, הייתה שונה באופן משמעותי. בהעדר PDCD4 ההפצה של שני mRNAs אלה מוסטת לribopolysomes הכבד (1D איור, E). מכיוון שזו אינה מלווה בשינויים ברמות מצב היציב של XIAP וBcl-XL mRNA (איור 1F) תוצאות אלו מראות משופרים תרגום של XIAP וBcl-XL בתאים עם רמות PDCD4 מופחתות, אשר אושר גם על ידי מערבי (איור סופג 1G). איור 1:. פרופיל Polysome מזהה PDCD4 כמעכב סלקטיבי של תרגום XIAP וBcl-XL () טופלו HEK293 תאים עם PDCD4 siRNA או שליטה (CTRL), ללא מיקוד siRNA, lysed ונתון ניתוח כתם מערבי עם אנטי PDCD4 ונוגדנים נגד Nucleolin כדי לוודא את מידת PDCD4 לדפוק למטה. (ב) PDCD4 ופל כמו ב() וlysates התא היו נתונים לpolysome פרופיל. פרופיל polysome נציג מוצג בפנל העליון; חלוקת הלא IRES XIAP (C), Bcl-XL (ד '), וXIAP IRES (E) mRNAs ביחס לזה של GAPDH מוצג כאחוז מה- mRNA הכולל (% mRNA) בכל חלק. (F) יציב רמות ה- mRNA -state נמדדו על ידי RT-qPCR בPDCD4 siRNA או שליטה (CTRL) siRNA תאים שטופלו. (G) lysates מ (A) גם היו נתונים לניתוח כתם מערבי עם אנטי XIAP, אנטי-Bcl-XL, ו נוגדנים נגד Nucleolin. (NB. הנתונים המוצגים באיור 1 פורסם במקור ב -12) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

פרופיל Polysomal הוא טכניקה רבת עוצמה שמאפשרת כימות של מדינת תרגום של תמלילים מסוימים בתנאי טיפול שונים. זוהי טכניקה פשוטה מאוד באופן עקרוני ובכל זאת דורשת מספר שלבים של ביצוע, שחלקם הם קריטיים לייצור פרופילי polysome טובים. שלבים העיקריים אלה הם: 1) שימוש בכימיקלים וplasticware RNase חינם, 2) הכנה הדרגתיים סוכרוז טוב (הדרגתיים סוכרוז 10-50% בניסיון שלנו עובדים הכי טוב עבור יעילות פתרון 40 / 60S יחידות משנה וmRNAs עם ריבוזומים קשורים), ו- 3 ) תוך שימוש בתאים שגדלים באופן אקספוננציאלי ולא מחובר יותר מ -80% על מנת ללכוד את השיעור הגבוה ביותר של תרגום. צעד אחרון זה צריך להילקח בחשבון כאשר עושים טיפולי תא ארוכים, כגון מציאה גן או ביטוי יתר, כך שהסכום של תאים לצלחת יהיה פונקציה של כמה התאים יהיו מחוברים בנקודת הסיום.

בתוצאות presenטד כאן, polysome ניתוח הפרופיל היה כלי חשוב להערכת תפקיד PDCD4 בויסות התרגום של mRNAs XIAP וBcl-XL ^12-מחסה IRES. העובדה שאנו לא צופים כל שינוי בפרופילי polysome הכלליים על PDCD4 לדפוק למטה (איור 1) אפשרה לנו להגיע למסקנה כי PDCD4 לא לפגוע בתרגום סלולארי הגלובלי בתנאים של הניסוי. אנחנו הבאים עשינו שימוש בניתוח RT-qPCR כדי לקבוע את חלוקת XIAP וBcl-XL mRNAs בתאים שטופלו עם PDCD4 או siRNAs שליטה. qPCR הוא שיטת בחירה של ניתוח פרופילי polysome, בניגוד לסטנדרטי RT-PCR או סופג צפון, משום שהוא מאפשר ללא כמו ניתוח חצי כמותית של הפצת mRNA ולגילוי שינויים דקים בtranslational יעילות בין טיפולים. השימוש בטכניקה זו, הצלחנו להראות כי ההפצה של mRNAs Bcl-XL XIAP ו( כאחוז מכלל mRNA היעד על פני גרadient) היה עבר בצורה משמעותית לpolyribosomes הכבד (mRNAs עם מספר גדול של ריבוזומים הקשורים בם) לאחר PDCD4 לדפוק למטה (1D איור, E), וכך מצביעה על עלייה בתרגום של mRNAs אלה. זה אושר גם על ידי עלייה ברמות חלבון XIAP וBcl-XL אבל לא ברמות RNA המצב היציב שלהם (איור 1F, G). חשוב לציין, הפצת polysome של הגרסה הלא-IRES של XIAP הייתה ללא שינוי בין תאים שטופלו ולא טופלו (איור 1 ג '). לחלופין, יעילות translational יכולה להיות מוצגת כיחס בין תוכן mRNA בpolysomes (בדרך כלל שברי 5 עד 10) לעומת monosomes (בדרך כלל שברים 2 עד 4) ^14.

השימוש בבקרות בכל הפרוטוקול חשוב באימות כל polysome פרופיל תוצאה, כפי שניתן לא בכוחות עצמם לייחס פסגות שנצפו מקריאות ספיגה ב 254 ננומטר ל- RNA ריבוזומלי (חומר ניקוישל, כגון טריטון X-100 מאוד לספוג באזור זה של הספקטרום ועלול לטשטש 40 / 60S פסגות בחלק העליון של השיפוע). מילויים ריקים ללא lysate ו / או עם חיץ lysate צריכים להפעיל כדי לקבוע את תרומתו היחסית של המאגרים לספיגה ב 254 ננומטר. Artefactual מבנים מסדר גבוהים יותר גם יכולים להוביל לפרשנות מוטעה של polysomes שבו יש באף עובדה (לדוגמא "פסאודו-polysomes" ^20). Sequestering מגנזיום (המשמש בכל ההליך כדי לייצב 80S ריבוזומים) עם EDTA chelator קטיון דו הערכי הוסיף לlysates ולמאגר שהשיפוע (20 מ"מ במשך 15 דקות) יגרום הפרדה של הריבוזום לקטן (40S) המרכיב אותה וגדול (60S תת-יחידות). לכן, אם פסגות ספיגה נרשמו ב 260 ננומטר הן אכן polysomes, טיפול EDTA יקרוס הפרופיל כזה שמקסימום יחיד יהיה שנצפה בחלק העליון של שיפוע המתאים לשחרור ה- mRNA ויחידות ריבוזומלי (מידע לא מוצג). ביחדעם קריסה מושרה EDTA של הפרופיל, כל המטרות הספציפיות נותחו על ידי qPCR צריך להימצא כעת בחלק העליון של השיפוע.

מספר ריבוזומים הקשורים mRNA הוא לא תמיד אינדיקציה למידת היעילות שmRNA מסוים מתורגם. ואכן, יש הקשרים ספציפיים שבו תרגום פעיל בpolysomes הופך תקוע ^21,22 שהקורא צריך להיות מודע. קביעה אם או לא תמלילים עוסקים באופן פעיל עם מכונות התרגום יכולים להיעשות על ידי) טיפול במדגם עם puromycin, שלא כמו EDTA, גורם ל'ניגר 'של ריבוזומים שבאופן פעיל translocating פני mRNA, או ב) טיפול במדגם עם homoharringtonine אשר מעכב טרנסלוקציה של הריבוזום הראשון רק בקודון ההתחלה, שוב גורם ל'ניגר 'של כל ריבוזומים translocating במורד הזרם.

השימוש בתמלילי שליטה לניתוח qPCR הוא גם קריטי. אין התמיכה בבחירהtion של תמלילים שאינם מושפעים מהתנאים טיפול שונים, כגון גנים מסוימים במשק בית (GAPDH, אקטין, טובולין, Nucleolin), mRNAs ריבוזומלי (18S, RPL13A) או במקרה זה גרסה הלא-IRES של IRES XIAP, הוא חשוב ב האימות אם ההשפעה של הטיפול על תרגום היא ספציפית או כללי. תמלילי שליטה אלה יכולים לשמש כדי לנרמל את ההפצה של mRNAs ניתח כפי שנעשה כאן (mRNAs XIAP וBcl-XL היה מנורמל GAPDH mRNA ומבוטא באחוזים מכלל תוכן mRNA המיוצגים בסכום של תוכן mRNA בכל שבריר ) או לחלופין, יכול לבוא לידי ביטוי mRNAs היעד והשליטה כערכים מוחלטים ומוצג בנפרד. ניתוח qPCR של lysates הקלט (בדרך כלל 10% מנפח כולל) הוא צעד נוסף שישלוט על חלוקת mRNAs הספציפי. באופן אידיאלי, תוכן mRNA של תמליל ספציפי בlysate הקלט צריך להיות דומה לסכום של תוכן mRNA בכל 10 הברים ניתחו. לבסוף, צעד אופציונאלי לשליטה לפנול: שלב חילוץ כלורופורם הוא ספייק כל חלק polysome עם במבחנה mRNA כתב עיבד (כגון CAT, אצטיל כלורמפניקול transferase) שניתן לכמת בהמשך על ידי qPCR ויכול גם לשמש כדי לנרמל ¹⁴ נתונים.

כמו בכל טכניקה, פרופיל polysome מציג כמה מגבלות. העובדה שבדרך כלל מינימום של 10 שברים (משמרות עדינות יותר ביעילות תרגום עשויה לדרוש יותר או 20) צריכה להיות שנאספו על מנת לקבל הפצות polysome נחמדה עושה את הצעד הזה הגבלה, במובן זה שרק למקסימום של 4 דגימות יכול להיות ניתח בכל פעם כדי שתוכל לטפל בנוחות מיצוי RNA וניתוח qPCR של 40 דגימות ובקרת 4 קלט בבת אחת. גודל המדגם יכול בקלות להוסיף עם כמה תמלילים להיות מנותחים וכמה qPCR משכפל לעשות, וזה יכול להיות יקר. מגבלה נוספת של פרופיל polysomal מבוסס qPCRnalysis הוא שזה יכול להיעשות רק על גישה מבוססת מועמד (שבו התמלילים להיות מנותחות ידועים מראש) ולא יכולים להיות מיושמים לניתוח הגנום של תרגום. עם זאת, בתחילת המאה ה ^-21, חוקרים החלו לחקור RNA polysomal שלהם ברמה גנומית באמצעות DNA microarrays ¹⁵ ולאחרונה עם רצף של הדור הבא ^16,17. בגישה זו עוצמה, פרופיל polysomal מתבצע כפי שתואר בפרוטוקול זה אלא שבמקום לבצע ניתוח qPCR של שברים בודדים, monosomes שברים (בדרך כלל חלק 2-4) וpolysomes שברים (בדרך כלל שברים) הם אספו יחד ושינויים בתרגום העולמי נתח על ידי מערך DNA או RNA רצף הגנום. מכאן עם גישה זו, ניתן להעריך את כל mRNAs הפצה שמשמרות מpolysomes לmonosomes (ירידה בתרגום) או להיפך (עלייה בתרגום) על טיפול ספציפיment. אימות וכימות הפצת polysomes mRNA ספציפית אז יכולים להיעשות על ידי qPCR. שימוש אפילו יותר חזק של עיקרון פרופיל polysomal הוא פרופיל הריבוזום. הארכת תפוקה גבוהה נוספת של טכניקה זו דווחה לאחרונה, המאפשרת ניטור בו-זמני של מאות polysome שברים ^23. זה מספק יתרון ברור כאשר חיטוט יעילות translational של אוספי מוטציה או במסכי RNAi בקנה מידה גדולה. פרופיל הריבוזום הוא טכניקה שמנצלת רצף של הדור הבא למפה שברי RNA מוגנים על ידי ריבוזומים (עקבות הריבוזום) העוסקים בסינתזה של חלבוני ^24,25. בטכניקה זו, טרנסלוקציה הריבוזום יכולה להיות מעוכבת עם cycloheximide (הפיך) או emetine (בלתי הפיך) ואחריו תמוגה תא ועיכול RNase להניב אוכלוסייה של עקבות הריבוזום. הריבוזומים מועשרים, RNA הכולל מבודד, וריבוזומלי זיהום וRNA ריבוזומלי המיטוכונדריה מוסר.עקבות RNA של כ 26-28 נוקלאוטידים מבודדות, הפוך עיבד, הפך לספריית cDNA והרצף ^26. בניגוד לפרופיל polysome סטנדרטי, גישה זו לא רק מזהה mRNAs הספציפי שמוסדרים translationally אלא גם מניבה מידע mRNA הספציפי ברזולוציה קודון כגון כיבוש המדויק וצפיפות של ריבוזומים לאורך תמליל ספציפי. זה מעניין בעיקר לmRNAs עם מצבים ספציפיים של תרגום כגון mRNAs IRES-מחסה, כפי שהוא יכול לתת מידע נוסף על מיקום בהריבוזומים לגיוס התמליל מתרחש.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Gradient Master 108 automated gradient maker	BIOCOMP	107-201M
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker	LABCONCO	4517000
Beckman Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Model # L-100-XP
Density gradient fractionator	TELEDYNE ISCO	69-3873-246	Composed of: tube piercing system,  peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector
WinDaq data acquisition software	DATAQ INSTRUMENTS	WINDAQ/LITE	http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14×89 mm)	Beckman Coulter	331372
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)	DiaMed	PRE1900-N
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)	SafeSeal	12000
Sucrose (nucleases-free)	Calbiochem	573113	MW = 342.3 g/mol
Cycloheximide	SIGMA	C7698	MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.
Sodium chloride (nucleases-free)	OmniPur	7710	MW = 58.44 g/mol
MgCl2.6H2O (nucleases-free)	OmniPur	5980	MW = 203.3 g/mol
Tris Base (nucleases-free)	J.T. Baker	4109-01	MW = 121.14 g/mol
Triton X-100	OmniPur	9400	Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega	N2515
RNaseZap Rnase inactivation solution	Ambion, Life Technologies	AM9780
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)	Invitrogen, Life Technologies	AM9516
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	Ambion, Life Technologies	AM9722	Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion