肝脏活体如下显微成像<em>利什曼原虫</em>感染：肝脏血流动力学的评估
Summary
This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.
Abstract
活体显微镜（IVM）是已经成为可能在实时和在活体动物各种生物事件的可视化，监测和量化一个强大的光学成像技术。该技术极大地提高了我们的生理过程，并在特定器官病原体介导的现象的理解。
在这项研究中，IVM施加到小鼠肝脏和协议设计为图像在体内肝脏的循环系统，并测量在个体肝脏血管的红血细胞（RBC）的速度。为了显现不同容器亚型表征肝器官和执行血流速度的测量，之C57B1 / 6小鼠进行静脉内注射一种荧光等离子体试剂标签的肝相关脉管。 IVM能够在体内实时，红细胞速度的测量中感兴趣的特定容器中。建立这一方法将使得能够研究生理和病理条件下肝血流动力学。最终，这种基于成像的方法将是非常重要的研究L的影响原虫感染对肝脏血流动力学。
这种方法可以适用于其它感染模型和小鼠的器官和可能进一步扩展通过量化其对血流量的影响预临床的炎症的药物的效果的测试。
Introduction
器官特异性血流动力学是任何哺乳动物器官重要的生理功能。血流异常可能是炎症的后果和器官功能障碍1的标志。因此，血液流动的组织，结构和功能出现生理和病理条件下进行分析的关键参数。已普遍用于分析在特定器官的血流量的技术包含一些限制，包括技术本身的分辨率极限（ 例 如血流的多普勒成像），为的绝对血液流量只（体积的血液每次测量的能力单元服务器官）（ 例如光学相干断层扫描）和在速度在大量异质群体血管2,3的平均变化的测量。肝脏的循环系统链接不同容器亚型是异质在它们的大小，结构和功能。在这项研究中，活体显微镜（IVM）成像技术被应用到评估肝脏血流动力学体内，实时，在高分辨率和在平行于揭露的组成该肝器官的个体的血管的特征。这个强大的光学成像技术的最新发展使研究人员收集的动物生活在高时空分辨率的动态数据。通过允许直接可视化和体内特异性和快速生物过程的实时监控，IVM提供了一个独特的机会，研究者将图像的个别血管，并测量和量化单个红血球内的特别选定的速度（RBC）肝血管。
在这项研究中，我们已经实现了在小鼠肝脏的IVM技术研究小鼠感染的肝血流动力学的嗜肝寄生虫利什曼原虫的影响。L.原虫负责内脏利什曼病，严重的疾病，其特征急性上慢性炎症反应和病理学，其存在于多个器官，包括脾和肝脏中的试剂。内脏利什曼病的实验小鼠模型中，肝感染是自我解决，而脾感染是渐进4。 利什曼原虫属感染的相对于该个体的器官，这些结果仍然没有完全了解。肝，脾血流动力学病理状态下调查将揭示宿主相互作用的寄生虫和疾病发病机制的新光源。
我们的实验模型系统是基于曝光和成像接受静脉注射特异性的荧光染料对肝intravasculature的标记麻醉小鼠的肝脏。肝脏是一个有利的器官内活体显微镜。执行一个小incisio后中的n腹部，肝脏轻轻外在并置于湿纱布，然后在与减少由于心跳和呼吸的任何运动伪影的目标盖玻片。肝脏，然后放置在显微镜透镜的视图内。相比于需要使用两个光子显微镜对IVM研究脾和淋巴结，肝的优势在于其均质3D架构/解剖学，允许使用常规共焦显微镜，具有最大穿透深度约50微米，对于活体显微镜成像5-8。
这项研究描述了两个独立的成像方法是在个别血管红细胞流速和血流速度的定量测量。在第一种方法中，使用的是XY二维的模式随时间获取肝脏血流量。所得XYT数据使用MtrackJ插件在自由的ImageJ软件，其允许individ的跟踪分析UAL红细胞随着时间的推移。在第二种方法中，一个单一的血管被选择及其相应的血流是利用共焦激光扫描显微镜的线扫描快速采集模式进行分析。感兴趣的容器被扫描在沿其中心轴的高频通过的轴线。血流速度，然后根据在未标记暗红细胞和荧光标记的等离子体之间的对比度的差量化。沿着线扫描中获得的红细胞和血浆的荧光强度对时间作图，得到的条纹，角度，其中成比例的单个红细胞的速度。
本文的目的是提供肝个别血管内的简单和可再现的方法进行成像并测量血流速度，并备妥的基本工具小鼠手术，IVM和速度的定量分析的成功表现个别红细胞。 Ť他的做法将允许研究人员获得病理状态下新的见解血流速度。
Protocol
Representative Results
Discussion
小鼠肝脏的活体显微镜的最近发展开辟了在体内和实时5,9,10生理响应于感染的调查新的可能性。器官的血流量是一个关键的生理参数是经常改变的许多疾病。然而，生理和传染性条件下肝脏血流动力学的状态仍然是一个探索不良的区域。在这项研究中，IVM为基础的方法，这在以前适于脾和肿瘤脉管系统的研究中，实施了以量化在单个容器内肝脏血流速度，并测量在体内 11…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究是由INSERM，艾克斯 – 马赛大学和HFSPO由CL弗赖斯获得职业发展奖的支持。
Materials
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24×60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
Referências
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