Intravitale Microscopie Imaging van de lever volgende<em> Leishmania</em> Infectie: een beoordeling van de lever Hemodynamica
Summary
This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.
Abstract
Intravitale microscopie (IVM) is een krachtige optische beeldvormende techniek die de visualisatie, bewaking en kwantificering van verscheidene biologische processen in real time en in levende dieren mogelijk gemaakt. Deze technologie is sterk geavanceerde ons begrip van fysiologische processen-pathogeen gemedieerde verschijnselen in specifieke organen.
In deze studie wordt IVM toegepast op de muizenlever en protocollen zijn ontworpen om de beeldpositie in vivo de bloedsomloop van de lever en meet rode bloedcel (RBC) snelheid in afzonderlijke vaten lever. Om de verschillende subtypes vaartuig dat de lever orgaan karakteriseren visualiseren en uitvoeren bloedstroom snelheidsmetingen worden C57BL / 6-muizen intraveneus geïnjecteerd met een fluorescent reagens dat de plasma-lever geassocieerde vasculatuur labels. IVM maakt in vivo, real-time meting van RBC snelheid in een bepaald vaartuig van belang. Vaststelling van deze methodologie zal het mogelijk te makenonderzoeken lever hemodynamiek onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Uiteindelijk zal dit imaging-gebaseerde methodologie belang zijn voor het bestuderen van de invloed van L. donovani infectie op de lever hemodynamiek.
Deze methode kan worden toegepast op andere infectieuse modellen en muis organen en kunnen verder worden uitgebreid pre-klinisch testen van een drug effect op de ontsteking door het kwantificeren van het effect op de bloedstroom.
Introduction
Organ-specifieke hemodynamica zijn belangrijke fysiologische kenmerken van elke zoogdieren orgaan. Afwijkingen in de bloedstroom kan het gevolg zijn van een ontsteking en een teken van orgaanstoornissen 1 zijn. Aldus bloedstroom organisatie structuur en functie lijken kritische parameters voor analyse onder fysiologische en pathologische omstandigheden. De technieken die gewoonlijk zijn gebruikt voor het analyseren van bloedstroming in een bepaald orgaan bevatten verscheidene beperkingen, waaronder de resolutiegrens van de techniek zelf (bijvoorbeeld Doppler beeldvorming van bloedstroming), het vermogen tot het meten van absolute bloedstroom slechts (hoeveelheid bloed per eenheid die een orgaan) (bv Optical Coherence Tomography) en het meten van de gemiddelde veranderingen in snelheid een grote en heterogene populatie van bloedvaten 2,3. Bloedsomloop van de lever koppelt verschillende vaartuig subtypes die heterogeen in omvang, structuur en functie zijn. InDeze studie, intravitale microscopie (IVM) beeldtechnologie toegepast op lever hemodynamica evalueren in vivo, in real time, met een hoge resolutie en parallel met de kenmerken van de individuele bloedvaten die de lever orgaan omvatten ontdekken. De recente ontwikkeling van deze krachtige optische beeldvormende techniek kan de onderzoeker dynamische gegevens te verzamelen op levende dieren bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Doordat de directe visualisatie en real time monitoring van specifieke en snelle biologische processen in vivo, IVM biedt een unieke gelegenheid om de onderzoeker op de foto om individuele bloedvaten, en meten en kwantificeren van de snelheid van enkele rode bloedcellen (RBC) binnen een specifiek geselecteerd lever schip.
In deze studie hebben we de IVM techniek in de muizenlever uitgevoerd om de invloed van muis infectie door het hepatotrope Leishmania parasiet lever hemodynamiek onderzoeken. L. donovanimandataris is verantwoordelijk voor viscerale leishmaniasis, ernstige ziekte gekenmerkt door acuut op chronische inflammatoire reacties en pathologie die in meerdere organen, zoals de milt en de lever. In een experimenteel muizenmodel van viscerale leishmaniasis, de lever infectie zonder behandeling terwijl de milt infectie progressief 4. Deze uitkomsten van Leishmania infectie met betrekking tot de individuele organen nog niet volledig begrepen. Onderzoek van de lever en de milt hemodynamiek onder pathologische omstandigheden zal een nieuw licht werpen op gastheer-parasiet interacties en ziekte pathogenese.
Ons experimentele model is gebaseerd op het blootstellen en beeldvorming van de lever van een verdoofde muis die intraveneuze injectie van specifieke fluorescente kleurstoffen ontvangen voor de etikettering van de lever intravasculature. De lever is gunstig orgaan voor intra-vitale microscopie. Na het uitvoeren van een kleine incision in de buik, wordt de lever voorzichtig buiten gebracht en geplaatst op nat gaasje en vervolgens op een dekglaasje met de doelstelling om eventuele bewegingsartefacten als gevolg van hartslag en ademhaling. De lever wordt vervolgens binnen het oog van een microscoop lens geplaatst. In vergelijking met de milt en lymfeklieren die het gebruik van twee foton microscopie voor IVM studies nodig, het voordeel van de lever ligt in de homogene 3D architectuur / anatomie die het mogelijk maakt het gebruik van een conventionele confocale microscoop met een maximale penetratiediepte van ongeveer 50 urn voor intravitale microscopie imaging 5-8.
In deze studie worden twee onafhankelijke beeldvormende methoden voor de kwantitatieve meting van RBC snelheid en bloed stroomsnelheid in afzonderlijke bloedvaten. In de eerste werkwijze wordt leverbloedstroom verkregen met behulp van een xy tweedimensionale functie in de tijd. De resulterende XYT gegevens geanalyseerd met de MtrackJ plugin in de vrije ImageJ software, die zorgt voor het volgen van indiUAL RBC in de tijd. In de tweede methode wordt een bloedvat geselecteerd en de bijbehorende bloedstroom wordt geanalyseerd met de lijnaftasting snelle acquisitie modus van de confocale laser scanning microscoop. Het schip van de rente wordt gescand bij hoge frequentie langs de centrale as door een axiale lijn. De bloedstromingssnelheid wordt vervolgens gekwantificeerd op basis van het verschil in contrast tussen ongelabelde donker erytrocyten en fluorescent gelabelde plasma. De fluorescentie-intensiteiten van RBC en plasma verkregen langs de lijn scan zijn tegen de tijd uitgezet om strepen te verkrijgen, de hoeken van die evenredig zijn met de snelheden van een individuele RBC.
Het doel van dit artikel is een eenvoudige en reproduceerbare werkwijze voor beeldvorming en meting bloedstroomsnelheid binnen afzonderlijke bloedvaten van de lever, waarna de beschikbare maken de fundamentele hulpmiddelen voor de succesvolle uitvoering van muis chirurgie, IVM en kwantitatieve analyse van de snelheid van individuele RBC. Tzijn aanpak kunnen de onderzoekers tot nieuwe inzichten in het bloed snelheid te winnen onder pathologische omstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De recente ontwikkeling van intravitale microscopie van de muizenlever opent nieuwe mogelijkheden voor het onderzoeken van de fysiologische reactie op infectie in vivo en in real time 5,9,10. Organ bloedstroom kritische fysiologische parameter die vaak wordt veranderd bij vele ziekten. Echter, de status van de lever hemodynamiek onder fysiologische en besmettelijke aandoeningen blijft een slecht onderzocht gebied. In deze studie IVM-gebaseerde werkwijzen, die eerder zijn aangepast voor de studie van …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de INSERM, de Universiteit van Aix-Marseille en een Career Development Award van HFSPO verkregen door CL Forestier.
Materials
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24×60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
Referências
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
