निम्नलिखित जिगर के intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग<em> लीशमैनिया</em> संक्रमण: यकृत hemodynamics के एक आकलन
Summary
This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.
Abstract
Intravital माइक्रोस्कोपी (IVM) वास्तविक समय में और जीवित पशुओं में विभिन्न जैविक घटनाओं के दृश्य, निगरानी और मात्रा का ठहराव संभव बना दिया है कि एक शक्तिशाली ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक है। यह तकनीक काफी शारीरिक प्रक्रियाओं और विशिष्ट अंगों में रोगज़नक़ की मध्यस्थता घटना के बारे में हमारी समझ को विकसित किया है।
इस अध्ययन में, IVM माउस जिगर के लिए लागू किया जाता है और प्रोटोकॉल तैयार कर रहे हैं छवि के लिए vivo में जिगर की संचार प्रणाली और व्यक्तिगत यकृत वाहिकाओं में लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) वेग को मापने। यकृत अंग की विशेषताएँ कि विभिन्न पोत उपप्रकार कल्पना और रक्त प्रवाह की गति मापन का प्रदर्शन करने के लिए, C57BL / 6 चूहों नसों के जिगर से जुड़े वैसक्यूलेचर लेबल है कि एक फ्लोरोसेंट प्लाज्मा अभिकर्मक इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं। IVM ब्याज की एक विशिष्ट पोत vivo में, वास्तविक समय, आरबीसी वेग की माप में सक्षम बनाता है। इस पद्धति की स्थापना के लिए यह संभव कर देगाशारीरिक और रोग की शर्तों के तहत जिगर hemodynamics की जाँच। अंततः, इस इमेजिंग आधारित पद्धति एल के प्रभाव के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण होगा यकृत hemodynamics पर डोनोवनी संक्रमण।
इस विधि अन्य संक्रामक मॉडल और माउस अंगों को लागू किया जा सकता है और आगे रक्त के प्रवाह पर उसके प्रभाव को बढ़ाता द्वारा सूजन पर एक दवा के प्रभाव का परीक्षण नैदानिक पूर्व करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Introduction
अंग-विशेष hemodynamics किसी भी स्तनधारी अंग की महत्वपूर्ण शारीरिक विशेषताएं हैं। रक्त के प्रवाह में असामान्यताएं सूजन का परिणाम और अंग में शिथिलता 1 का संकेत हो सकता है। इस प्रकार, रक्त का प्रवाह संगठन, संरचना और समारोह शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत विश्लेषण के लिए के रूप में महत्वपूर्ण पैरामीटर दिखाई देते हैं। आमतौर पर एक विशेष अंग में रक्त के प्रवाह का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि तकनीक तकनीक के ही संकल्प सीमा सहित कई सीमाओं के होते हैं (उदाहरण के लिए रक्त के प्रवाह की डॉपलर इमेजिंग), प्रति रक्त की केवल (मात्रा पूर्ण रक्त के प्रवाह की माप के लिए क्षमता एक अंग) (जैसे ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी) और रक्त वाहिकाओं 2,3 के एक बड़े और विषम जनसंख्या में गति में औसत परिवर्तन की माप की सेवा करने वाली इकाई। जिगर की संचार प्रणाली उनके आकार, संरचना और समारोह में विषम रहे हैं कि अलग पोत उपप्रकार जोड़ता है। मेंइस अध्ययन, intravital माइक्रोस्कोपी (IVM) इमेजिंग तकनीक उच्च संकल्प पर वास्तविक समय में, विवो में जिगर hemodynamics मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जाता है और समानांतर में यकृत अंग शामिल है कि व्यक्ति के रक्त वाहिकाओं की विशेषताओं को उजागर करने के लिए। इस शक्तिशाली ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के हाल ही के विकास के शोधकर्ता एक उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प पर जानवरों के रहने पर गतिशील डेटा एकत्र करने के लिए अनुमति देता है। प्रत्यक्ष दृश्य और vivo में विशिष्ट और तेजी से जैविक प्रक्रियाओं के वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देकर, IVM छवि व्यक्ति रक्त वाहिकाओं के लिए शोधकर्ता के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है, और मापने के लिए और एक विशेष रूप से चयनित भीतर ही लाल रक्त कोशिकाओं के वेग (आरबीसी) यों यकृत पोत।
इस अध्ययन में, हम जिगर hemodynamics पर hepatotropic लीशमैनिया परजीवी द्वारा माउस संक्रमण के प्रभाव की जांच करने के लिए माउस जिगर में IVM तकनीक को लागू किया है। एल डोनोवनीआंत लीशमनियासिस, तीव्र-पर-जीर्ण सूजन प्रतिक्रियाओं द्वारा विशेषता एक गंभीर बीमारी है और प्लीहा और यकृत सहित कई अंगों में मौजूद है कि एक विकृति के लिए जिम्मेदार एजेंट है। आंत लीशमनियासिस के एक प्रयोगात्मक माउस मॉडल में, यकृत संक्रमण स्वयं को हल करने प्लीहा संक्रमण 4 प्रगतिशील है, जबकि है। अभी भी पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं अलग-अलग अंगों के संबंध में लीशमैनिया संक्रमण के इन परिणामों। रोग की स्थिति के तहत जिगर और तिल्ली hemodynamics की जांच मेजबान परजीवी बातचीत और रोग रोगजनन पर नया प्रकाश डाला जाएगा।
हमारे प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली को उजागर करने और यकृत intravasculature की लेबलिंग के लिए विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंगों की नसों में इंजेक्शन प्राप्त है कि एक anesthetized माउस के जिगर इमेजिंग पर आधारित है। जिगर इंट्रा-महत्वपूर्ण माइक्रोस्कोपी के लिए एक अनुकूल अंग है। एक छोटे से incisio प्रदर्शन के बादएन पेट, जिगर धीरे externalized जाता है और फिर दिल की धड़कन और श्वसन की वजह से किसी भी प्रस्ताव कलाकृतियों को कम करने के लक्ष्य के साथ एक coverslip पर, गीला धुंध पर रख दिया गया। जिगर फिर एक माइक्रोस्कोप के लेंस के दृश्य के अंदर रखा गया है। IVM अध्ययन के लिए दो photon माइक्रोस्कोपी के उपयोग की आवश्यकता है, जो प्लीहा और लिम्फ नोड की तुलना में, जिगर का लाभ की एक अधिकतम प्रवेश गहराई के साथ एक पारंपरिक confocal खुर्दबीन के उपयोग के लिए अनुमति देता है कि इसके समरूप 3 डी वास्तुकला / शारीरिक रचना में निहित है लगभग 50 माइक्रोन, intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग 5-8 के लिए।
इस अध्ययन से व्यक्ति की रक्त वाहिकाओं में आरबीसी वेग और रक्त प्रवाह की गति के मात्रात्मक माप के लिए दो स्वतंत्र इमेजिंग तरीकों का वर्णन है। पहली विधि में, जिगर रक्त के प्रवाह को समय के साथ एक XY द्वि-आयामी मोड का उपयोग कर हासिल कर ली है। जिसके परिणामस्वरूप xyt डेटा individ की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है जो मुक्त ImageJ सॉफ्टवेयर में MtrackJ प्लगइन का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैंसमय के साथ यौन लाल रक्त कोशिकाओं। दूसरी विधि में, एक भी रक्त वाहिका चयन किया जाता है और अपनी इसी रक्त प्रवाह में confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप की लाइन स्कैनिंग तेजी से अधिग्रहण मोड का उपयोग कर विश्लेषण किया है। ब्याज के पोत एक अक्षीय लाइन के माध्यम से अपनी केंद्रीय धुरी के साथ उच्च आवृत्ति पर जांच होती है। रक्त का प्रवाह वेग तो unlabeled अंधेरे एरिथ्रोसाइट्स और fluorescently लेबल प्लाज्मा के बीच इसके विपरीत में अंतर के आधार पर मात्रा निर्धारित है। स्कैन लाइन के किनारे का अधिग्रहण लाल रक्त कोशिकाओं और प्लाज्मा के प्रतिदीप्ति तीव्रता धारियाँ प्राप्त करने के लिए समय के खिलाफ साजिश रची है, कोण, जिनमें से एक व्यक्ति आरबीसी के वेग के लिए आनुपातिक हैं।
इस अनुच्छेद के लक्ष्य जिगर के अलग-अलग रक्त वाहिकाओं के भीतर एक इमेजिंग के लिए सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि और मापने के रक्त प्रवाह वेग प्रदान करने के लिए और माउस सर्जरी, IVM और के वेग के मात्रात्मक विश्लेषण के सफल प्रदर्शन के लिए बुनियादी उपकरण उपलब्ध कराने के लिए है व्यक्तिगत लाल रक्त कोशिकाओं। टीअपने दृष्टिकोण शोधकर्ताओं रोग की स्थिति के तहत रक्त वेग में नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए अनुमति देगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
माउस जिगर के intravital माइक्रोस्कोपी के हाल ही के विकास vivo में और वास्तविक समय 5,9,10 में संक्रमण की शारीरिक प्रतिक्रिया की जांच के लिए नई संभावनाओं को खोलता है। अंग रक्त के प्रवाह को अक्सर कई रोगों में ब?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध INSERM, ऐक्स मारसैल विश्वविद्यालय और सीएल Forestier द्वारा प्राप्त HFSPO से एक कैरियर विकास पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24×60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
Referências
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