Intravital Mikroskopi avbildning av levern efter<em> Leishmania</em> Infektion: En bedömning av lever Hemodynamik
Summary
This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.
Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) är en kraftfull optisk bildteknik som har möjliggjort visualisering, övervakning och kvantifiering av olika biologiska händelser i realtid och i levande djur. Denna teknik har i hög grad avancerade vår förståelse av fysiologiska processer och patogen-medierad fenomen i specifika organ.
I denna studie är IVM appliceras på muslever och protokoll är utformade för att bilden in vivo cirkulationssystemet hos levern och mäta röda blodkroppar (RBC) hastighet i individuella lever fartyg. För att visualisera de olika fartygs subtyper som kännetecknar den hepatiska orgel och utföra blodflödet hastighetsmätningar är C57BL / 6-möss injicerades intravenöst med en fluorescerande plasma reagens som märker levern associerade kärlsystemet. IVM möjliggör in vivo realtid, mätning av RBC hastighet i ett visst fartyg av intresse. Etablering denna metod kommer att göra det möjligt attundersöka lever hemodynamik under fysiologiska och patologiska tillstånd. I slutändan kommer detta imaging baserad metod vara viktigt för att studera inverkan av L. donovani infektion på lever hemodynamiken.
Denna metod kan tillämpas på andra infektiösa modeller och musorgan och kan utvidgas ytterligare till pre-klinisk testning av ett läkemedels effekt på inflammatoriska sjukdomar genom att kvantifiera dess effekt på blodflödet.
Introduction
Organspecifika hemodynamiken är viktiga fysiologiska funktioner i alla däggdjursorgan. Avvikelser i blodflödet kan vara en följd av inflammation och ett tecken på organdysfunktion 1. Sålunda blodflöde organisation, struktur och funktion visas som kritiska parametrar för analys under fysiologiska och patologiska tillstånd. De tekniker som har vanligen användes för analys av blodflödet i ett specifikt organ innehåller flera begränsningar, inklusive upplösningsgränsen av tekniken i sig (t.ex. doppler avbildning av blodflödet), kapaciteten för mätning av absoluta blodflöde endast (volymen av blod per enhet som betjänar en orgel) (t.ex. optisk koherens tomografi) och mätning av genomsnittliga förändringar i hastighet i en stor och heterogen population av blodkärl 2,3. Levern cirkulationssystem kopplar olika fartygs subtyper som är heterogen i sin storlek, struktur och funktion. Idenna studie, intravital mikroskopi (IVM) bildteknik appliceras för att utvärdera lever hemodynamiken in vivo, i realtid, vid hög upplösning och parallellt för att avslöja egenskaperna hos de individuella blodkärlen som innefattar den hepatiska organet. Den senaste utvecklingen av denna kraftfulla optiska bildteknik gör det möjligt för forskare att samla in dynamiska data på levande djur vid en hög spatial och temporal upplösning. Genom att låta direkt visualisering och realtidsövervakning av specifika och snabba biologiska processer in vivo, ger IVM en unik möjlighet att forskaren fartyg bild individuell blod och mäta och kvantifiera hastigheten hos enskilda röda blodkroppar (RBC) i en speciellt utvalda hepatisk kärl.
I denna studie har vi genomfört IVM tekniken i muslever för att undersöka påverkan av infektions mus av hepatotropiskt Leishmania parasit på lever hemodynamik. L. donovaniär det medel som är ansvarigt för visceral leishmaniasis, en allvarlig sjukdom som kännetecknas av akut-på-kronisk inflammatoriska svar och en patologi som är närvarande i flera organ, inklusive mjälten och levern. I en experimentell musmodell av visceral leishmaniasis, är leverinfektion själv lösa medan mjälten infektionen är progressiv 4. Dessa resultat av Leishmania-infektion med avseende på de enskilda organen fortfarande inte helt klarlagd. Utredning av lever och mjälte hemodynamik i patologiska tillstånd kommer att kasta nytt ljus över värd-parasit interaktioner och sjukdom patogenes.
Vår experimentella modellsystem bygger på att exponera och avbildning levern hos en sövd mus som fick intravenös injektion av specifika fluorescerande färgämnen för märkning av lever intravasculature. Levern är ett gynnsamt organ för intra-vital mikroskopi. Efter att ha utfört en liten incision i buken, är levern försiktigt externalise och placeras på våt gasväv, sedan på en täck med målet att minska eventuella rörelseartefakter på grund av hjärtslag och andning. Levern placeras sedan inuti vy av en mikroskoplins. Jämfört med mjälten och lymfkörtel som kräver användning av två foton mikroskopi för IVM studier, fördelen av levern ligger i dess homogena 3D arkitektur / anatomi som möjliggör användning av en konventionell konfokalmikroskop, med ett maximalt inträngningsdjup av cirka 50 um, för intravital mikroskopi avbildning 5-8.
Denna studie beskriver två oberoende avbildningsmetoder för kvantitativ mätning av RBC hastighet och blodflöde hastighet i enskilda blodkärl. I den första metoden, är leverblodflödet förvärvats med hjälp av en xy tvådimensionell läge över tiden. De erhållna xyt data analyseras med användning av MtrackJ plugin i fri ImageJ mjukvara, som möjliggör spårning av individUAL RBC över tiden. I den andra metoden används en enda blodkärl väljs och dess motsvarande blodflöde analyseras med linjeavsöknings snabb följningsmoden för det konfokala lasersvepmikroskop. Kärlet av intresse skannas med hög frekvens längs dess centrala axel genom en axiell linje. Blodflödet hastigheten kvantifieras sedan baserat på skillnaden i kontrast mellan omärkta mörka erytrocyter och fluorescensmärkt plasma. De fluorescensintensiteter av RBC och plasma förvärvade längs linjeavsökningen plottas mot tiden för att få streck, vinklarna som står i proportion till de hastigheter för en enskild RBC.
Målet med denna artikel är att ge en enkel och reproducerbar metod för avbildning och mätning av blodflödeshastigheten inom enskilda blodkärl i levern och att tillhandahålla de grundläggande verktyg för en framgångsrik prestanda mus kirurgi, IVM och kvantitativa analyser av hastighet enskilda RBC. Thans inställning kommer att göra det möjligt för forskare att få nya insikter i blodhastigheten i patologiska tillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den senaste tidens utveckling av intravital mikroskopi av muslever öppnar nya möjligheter för undersökning av fysiologiska svar på infektion in vivo och i realtid 5,9,10. Organ blodflöde är en kritisk fysiologisk parameter som ofta ändras i många sjukdomar. Men statusen av lever hemodynamik under fysiologiska och infektiösa tillstånd fortfarande ett dåligt utforskade området. I denna studie, IVM-baserade metoder, som tidigare anpassade för studiet av mjälten och tumörvaskulatur, genom…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av INSERM, University of Aix-Marseille och en utmärkelse karriärutveckling från HFSPO erhålls genom CL Forestier.
Materials
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24×60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
Referências
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
