3 डी सेल संस्कृति मॉडल का मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के लिए तैयारी रणनीतियाँ नमूना
Summary
अमर कैंसर कोशिका लाइनों 3 डी सेल संस्कृतियों, जैविक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान मॉडल के रूप में विकसित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल नमूना तैयार मंच में सुधार सहित 3 डी सेल संस्कृतियों का मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग विश्लेषण के लिए 3 डी सेल संस्कृतियों को तैयार करने के लिए उपयोगकर्ताओं को हिदायत है।
Abstract
Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate de vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.
Introduction
Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1–4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5–7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8–11
3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12–14
All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15–21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर उल्लिखित विधियों का प्रयोग, 3 डी सेल संस्कृतियों हो गई है और MALDI-एमएसआई के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। जब उचित। 9,10 केयर, वह यह है भी कई बार पारित कर कम बीतने संख्या है नहीं किया गया है कि कोशिकाओं को खेती करने के लिए लिया जाना चाहिए सुसंस्कृत कई अमर सेल लाइनों 3 डी संरचनाओं बनेगी। सामान्य में, दस और कम बीतने के नंबर के साथ कोशिकाओं 3 डी सेल संस्कृतियों से बढ़ के लिए उपयोगी हैं। एक पारंपरिक agarose के समर्थन में 3 डी सेल संस्कृतियों बढ़ रहा है इस प्रणाली की कोशिश करने के लिए 3 डी सेल संस्कृति में रुचि अनुसंधान समूहों के लिए एक लागत प्रभावी तरीका प्रदान करता है। इस विधि नहीं पहले से ही सबसे स्तनधारी सेल संस्कृति प्रयोगशालाओं में कुछ घटकों का इस्तेमाल करता। सावधान ध्यान के विकास के लिए agarose प्लेटों की तैयारी करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए 3 डी सेल संस्कृतियों आकार और आकार में लगातार कर रहे हैं इतना है कि; सावधान ध्यान देने की जरूरत है कि कुछ पहलुओं कोई हवाई बुलबुले मिश्रण करने के लिए और एक उचित meniscus के प्रत्येक के नीचे डब्ल्यू पर बनता है कि फँस कर रहे हैं कि जाँच के शामिल हैंपक्ष। Meniscus के ठीक से फार्म नहीं करता है, कोशिकाओं गैर अंडाकार आकृति आकार में या छोटे गुच्छों में विकसित हो सकता है। इसके अलावा, देखभाल spheroids साथ जिलेटिन में पीबीएस जगह करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए। यदि ऐसा होता है, एक 200 μl पिपेट का उपयोग जिलेटिन के ऊपर से पीबीएस को हटा दें। लागत एक कारक नहीं है, अल्ट्रा कम बाध्यकारी दौर नीचे प्लेटों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और इन कदमों का सरलीकरण प्रदान करते हैं। अन्य ऊतक एम्बेडिंग तरीकों में भी महंगी और गैर-मास स्पेक्ट्रोमेट्री संगत हो सकता है, जिलेटिन एम्बेड सस्ती और बहुमुखी दोनों होना दिखाया गया है। 3 डी सेल संस्कृतियों उच्चतम गुणवत्ता डेटा प्राप्त करने के लिए ऊपर उल्लिखित तैयारी रणनीतियों अनुकूलित किया गया है। जिलेटिन एम्बेड मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ संगत होना दिखाया गया है, इस प्रक्रिया की वजह से सह क्रिस्टलीकरण के लिए उपलब्ध matrices के संकीर्ण करता है। जमे हुए एक बार, 3 डी सेल संस्कृतियों के रूप में लंबे समय तक वे फ्रीज thawed नहीं कर रहे हैं के रूप में महीने के लिए स्थिर रहे हैं। जिलेटिन जमे हुए जब अपारदर्शी हो जाता है, और 3 डी सेलसंस्कृतियों में एक समान रंग के होते हैं, तो यह टुकड़ा करने की क्रिया में सहायता करने के लिए 3 डी सेल संस्कृति नियुक्ति करने के लिए दस्तावेज़ ठंड से पहले सलाह दी जाती है।
स्लाइड्स की तैयारी, मैट्रिक्स कई अलग अलग तरीकों के साथ लागू किया जा सकता है, लेकिन यह कुछ matrixes व्यर्थ नमूना प्रतिपादन, ऐसे ferulic एसिड के रूप में जिलेटिन, के साथ सह-crystalize पाया गया है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। छोटे मैट्रिक्स क्रिस्टल अधिक सुसंगत जन स्पेक्ट्रा का उत्पादन। Handspotting मैट्रिक्स आवेदन का सरलतम विधि है, वहीं बड़े विलायक मात्रा बड़ा क्रिस्टल आकार और महत्वपूर्ण विश्लेष्य प्रवास में परिणाम कर सकते हैं।
मास स्पेक्ट्रोमीटर में, शुरुआत विश्लेषण के लिए आवश्यक विशेषज्ञता को कम कर दिया MALDI-एमएसआई प्रौद्योगिकियों में अग्रिम। डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण इतो में लिपटे स्लाइड से उच्च गुणवत्ता की जानकारी प्राप्त करने के लिए भी एक नौसिखिए की अनुमति के सबसे प्रणालियों, पर सीधा है। आस-पास के गैर छवि योग्य 3 डी सेल संस्कृतियों पर अनुकूलित साधन मापदंडों का चयन सावधानी से,तों, उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, लेजर शक्ति बढ़ती शिखर तीव्रता में वृद्धि हो सकती है, लेकिन लेजर शक्ति घटते संकल्प को बेहतर बनाने और अधिक सममित शिखर आकार दे सकते हैं। 3 डी सेल संस्कृतियों इष्टतम नमूना गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए टुकड़ा करने की क्रिया के बाद जल्दी से इस्तेमाल किया जाना चाहिए। प्रोटीन संकेत की गिरावट (20 केडीए ऊपर) विशेष रूप से उच्च द्रव्यमान क्षेत्र में, उचित भंडारण (dessicator / -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर) के बिना कम से कम एक सप्ताह में देखा जा सकता है। कारण बढ़ती मांग के कई अलग अलग दृश्य सॉफ्टवेयर प्रोग्राम विकसित और अनुसंधान जनता के लिए स्वतंत्र हैं किया गया है। अधिकांश इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमीटर प्रत्येक साधन का इस्तेमाल किया पर मालिकाना स्वरूपों के साथ ही आम जनता कल्पना करने के लिए आवश्यक सॉफ्टवेयर स्थापित किया है। ये सॉफ्टवेयर प्रोग्राम डेटा एकल बड़े पैमाने पर छवियों को प्राप्त करने और निर्यात करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सबसे सॉफ्टवेयर भी ब्याज की दो या दो से अधिक जनता की ओवरले की अनुमति देगा। इसके अतिरिक्त, एमएसआई डेटा के लिए कई अलग अलग दर्शकों को ऐसे MSiReader एक के रूप में, डाउनलोड करने के लिए स्वतंत्र हैंडी BioMap। भी आगे के लिए और अधिक उपयोगी जानकारी लाने में आसानी के साथ पोस्ट-अधिग्रहण संसाधित किया जा सकता प्राप्त 32,33 मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा।
प्रोटीन के लिए लिपिड को दवाइयों से, ऊपर उल्लिखित प्रणाली एक 3 डी सेल संस्कृति संरचना भर में ब्याज के अणुओं के वितरण का मूल्यांकन करने के लिए डेटा का तेजी से अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है। धारावाहिक वर्गों 3 डी सेल संस्कृति का एक टुकड़ा में से प्रत्येक के लिए 2 डी छवि से निर्माण करके छवि के लिए पूरे 3 डी संरचना लिया जा सकता है। प्रोटोकॉल में तकनीक और नोट्स monolayer की संस्कृति और पशु मॉडलों के बीच एक सेतु के रूप में तीन आयामी सेल संस्कृति शुरू करने के लिए बधाई देने के शोधकर्ताओं के काम का हो जाएगा। में महारत हासिल करने के बाद, इन तकनीकों वे चुन जो भी नमूने छवि के लिए शोधकर्ताओं की इजाजत दी, 3 डी सेल संस्कृतियों, ऊतकों, और सेल संस्कृतियों के कई प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| HCT116 Cell line | ATCC | ATCC CCL-247 | Potential hazard, handle with care |
| McCoy's 5A media | Gibco | 16600-108 | |
| Fetal Bovine serum | HyClone | SH30071.03 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA solution | Gibco | 25200-056 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010049 | |
| Gelatin, unflavored | Knox | — | Available at most grocery stores in single-packets |
| ITO-coated glass slides | Delta Technologies, Limited | CG-90IN-S115 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Sinapic Acid | Sigma-Aldrich | 85429 | |
| 0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set | RoyalMax Airbrush | — | Many options available on sites such as Amazon.com |
Referências
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