Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo C. elegans

Resumo

A propagação de agregados proteicos semelhante ao príon surgiu recentemente como implicada em muitas doenças neurodegenerativas. O objetivo deste protocolo é descrever como usar o nematóide C. elegans como um sistema modelo para monitorar a disseminação de proteínas e investigar fenômenos semelhantes a príons.

Resumo

Prions são partículas proteicas não convencionais de autopropagação, desprovidas de qualquer ácido nucleico codificador. Essas sementes proteicas servem como modelos para a conversão e replicação de sua isoforma celular benigna. Evidências acumuladas sugerem que muitos agregados de proteínas podem atuar como modelos de autopropagação e corromper o dobramento de proteínas cognatas. Embora os agregados possam ser funcionais sob certas circunstâncias, esse processo geralmente leva à interrupção da homeostase da proteína celular (proteostase), levando a doenças devastadoras, como doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), esclerose lateral amiotrófica (ELA) ou encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs). Os mecanismos exatos de propagação de príons e disseminação célula a célula de agregados proteicos ainda são objetos de intensa investigação. Para aprofundar esse conhecimento, recentemente foi estabelecido um novo modelo de metazoário em Caenorhabditis elegans, para expressão do domínio príon da proteína príon de levedura citosólica Sup35. Este modelo de príon oferece várias vantagens, pois permite o monitoramento direto do domínio do príon marcado com fluorescência em animais vivos e facilidade de abordagens genéticas. Aqui são descritos métodos para estudar o comportamento semelhante ao príon de agregados de proteínas e para identificar modificadores de toxicidade induzida por príons usando C. elegans.

Introdução

Muitas doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), a esclerose lateral amiotrófica (ELA), e encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET), estão associados a proteínas de agregação propensas e são, portanto, conhecidos coletivamente como proteína misfolding transtornos (EPM ). EET ou doenças provocadas por priões constituem uma classe única de EPM em que eles podem ser infecciosas em seres humanos e animais ^1. A nível molecular, prions replicar recrutando e convertendo monomérica α-hélice-rico codificado-host PrP celular (PrP ^C) para o patológico β-folha-rico conformação PrP ^{Sc 2,3.} Agregados de proteína auto-propagação também foram identificados em fungos, que partilham características importantes de mamíferos com priões ^4,5. Além disso, os priões mamíferos são capazes de mover a partir de célula-a-célula e infectar células naive ^6,7.

Enquanto EPM other do TSE não são infecciosos, eles compartilham um princípio patogênico comum com doenças de príon ^8,9. Embora as proteínas ligadas a cada um dos EPM não estão relacionados em termos de estrutura ou função, eles todos formam agregados por meio de um processo de cristalização, chamado nucleada ou semeada de polimerização; Além disso sementes proteicos crescer através do recrutamento de suas isoformas solúveis ^2,10,11. A eficiência para a auto-propagam in vivo varia, dependendo das propriedades intrínsecas da proteína, que, em conjunto com factores celulares adicionais, tais como as chaperonas moleculares, em última análise determinam as taxas de nucleação agregado, a sementeira, a fragmentação e espalhamento ^12-15. Por isso, deve haver um bom equilíbrio entre esses fatores que permite a propagação eficiente de agregação de proteínas. Isso também pode explicar por que apenas alguns agregados amiloidogénicas abrigar as características de um prião, e, assim, nem todos os EPM são infecciosas. Os príons parecem representar o 'top-performers'fa amplo espectro de agregados proteicos de auto-replicação, o que os torna uma ferramenta poderosa para estudar EPM ^8,13.

Curiosamente, a toxicidade associada com agregados relacionados com a doença muitas vezes tem um componente autônomo não célula ^16,17. Isto significa que eles afectam as células vizinhas que não expressam o gene correspondente, em contraste com um efeito estritamente autónoma célula, o que implica que apenas as células que expressam o gene exibem o fenótipo específico. Este foi convincentemente demonstrada pela expressão específica de tecido ou derrubar das respectivas proteínas em vários modelos de doenças neurodegenerativas ^18-26. Vários mecanismos têm sido sugeridos como uma base para esta não-toxicidade celular autônomo na EPM, incluindo o fornecimento de nutrientes diminuído, o desequilíbrio na sinalização neuronal, excitotoxicidade do glutamato, e neuroinflammation ^16,27,28. Além disso, um movimento de prião semelhante de agregados ligados de doenças entre as células might contribuir para este aspecto ^29,30. Uma evidência crescente sugere que outras inclusões de proteína que pode transmitir priões a partir de célula-para-célula, o que pode explicar a característica de difusão na patologia observada em muitos EPM ^30-36. No entanto, ele ainda não foi determinado se há um claro nexo de causalidade entre o movimento intercelular de proteínas doença eo efeito tóxico sobre as células vizinhas. Por conseguinte, um melhor entendimento das vias celulares que estão subjacentes a transmissão célula-a-célula e célula não autónomo toxicidade é necessária e essencial para o desenvolvimento de novas terapias. No entanto, muitos aspectos do prião como espalhando-celulares e factores que influenciam a transmissão célula a célula de proteínas mal enroladas em metazoários não são bem compreendidos, em particular ao nível dos organismos.

O nemátodo Caenorhabditis elegans tem várias vantagens que oferecem o potencial de descobrir novas facetas de spreadi prion-likeng em metazoans ^17. É transparente, permitindo a rastrear in vivo de proteínas marcadas fluorescentemente no organismo vivo. Além disso, muitos processos celulares e fisiológicas afectadas pela doença são conservados de vermes para a saúde humana, e C. elegans é também susceptível a uma grande variedade de manipulações genéticas e análises moleculares e bioquímicos ^37-39. Exatamente 959 células somáticas compõem o hermafrodita adulto com um plano corporal simples, que ainda tem vários tipos de tecidos diferentes, incluindo músculos, neurônios e intestino.

Para estabelecer um novo modelo de príon em C. elegans, que escolheu para expressar exogenamente a glutamina bem caracterizada / asparagina (Q / N) rico em prião NM domínio do cytosolic proteína de levedura prion Sup35, já que não há proteínas príon endógenas conhecidas em vermes ^4,40. Prions levedura foram inestimáveis ​​para elucidar os mecanismos básicos de prion replicação ^41-44. Além disso, NM é o abetoproteína prião como citosólica-r que tem sido mostrado para recapitular o ciclo de vida completo de um prião em cultura de células de mamífero ^45,46. Da mesma forma, quando expresso em C. elegans, o domínio prion Sup35 adotado muito bem com as diferentes necessidades para propagação em células metazoários em comparação com células de levedura e principais características expostas da biologia prion agregação ^40. NM foi associada com um fenótipo tóxico profunda, incluindo a ruptura da integridade mitocondrial e aparecimento de várias vesículas autofagia relacionados sobre o nível celular, bem como prisão embrionário e larval, atraso do desenvolvimento, e uma perturbação generalizada do ambiente dobramento de proteínas ao nível do organismo. Surpreendentemente, o domínio príon celular apresenta toxicidade autônoma e não autônomos celular, afetando tecidos vizinhos em que o transgene não foi expressa. Além disso, o transporte vesicular do domínio prião dentro e entre as células é monitorado em tempo real in vivo ^40.

Aqui nós descrevemos como examinar divulgação prion-like em C. elegans. Vamos explicar como monitorar o transporte intra e intercelular de vesículas contendo o domínio prion usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Vamos enfatizar o uso de sensores de dobradura de tecidos específicos e universalmente expressa repórteres de estresse para avaliar Cell efeitos autônomos autónomos e não sobre fitness celular. Finalmente, vamos descrever o procedimento de uma grande tela recentemente realizada genoma RNA de interferência (RNAi) para identificar novos modificadores de toxicidade induzida por prion. Em conjunto, estes métodos podem ajudar a provocar uma separação de caminhos genéticos envolvidos no movimento intercelular de proteínas e sua toxicidade autónoma non celular.

Protocolo

1. Monitoramento transcelular Espalhando de proteínas príon-like por In Vivo tempo-lapso

NOTA: Crescer C. elegans do tipo selvagem (WT) (N2) e linhas transgénicas de acordo com métodos padrão e controlar cuidadosamente a temperatura de cultivo ^47.

1. Gerar linhagens transgênicas de C. elegans que expressa a proteína prion-like, marcado com proteína fluorescente vermelha monomérica (MRFP). Assista a este vídeo que demonstra como usar a microinjeção ^48. Para mais detalhes e métodos que descrevem como integrar estas linhas extracromossómicos, consulte ^49.
2. Prepare populações sincronizadas por colocação de ovo ou branqueamento de acordo com métodos padronizados ^50.
   1. Sincronização de postura de ovos
      1. Transferência de 10-20 adultos grávidas em um prato e deixe que eles põem ovos por 1-2 horas. Remover adultos a partir da placa e deixar a crescer até a progenitura idade desejada.
   2. Sincronização por branqueamento
      1. Recolha uma população de adultos grávidos não sincronizado e branquear com uma solução de hipoclorito alcalino (NaOH a 250 mM e 1: 4 (v / v) diluição da lixívia comercial em H ₂ O). Lavar os ovos duas vezes (218 xg durante 1 min) com tampão M9 ⁴⁷ (21 MMNA ₂ HPO ₄ · 7H ₂ O, 22 mMKH ₂ PO _4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO · ₄ 7H ₂ O, adicionar _dH2O até 1 L).
      2. Permita-lhes a eclodir em tampão M9 com suave agitação O / N a 20 ° C. Desenvolvimento verme vai prender na fase L1 na ausência de uma fonte de alimento, deixando uma população sincronizada. Transfira para L1s fresco nematóides Crescimento Media (NGM) placas semeadas com OP50 E. coli bactérias e deixar a prole se desenvolver até a idade desejada ^47.

Prepare 2% almofadas de agarose (em H ₂ O) em uma lâmina de microscópio como descrito ^50.

1. Prepare dois microscope com lâminas de fita de rotulagem colocados ao longo de todo o seu comprimento para ser usado como espaçadores. Colocar uma terceira lâmina de microscópio entre eles.
2. Dissolve-se 2% de agarose em H ₂ O e uma pipeta de queda sobre a lâmina limpa.
3. Coloque uma quarta corrediça perpendicular aos outros três lâminas sobre o topo da gota de agar. Pressione levemente para baixo para achatar a almofada para a mesma espessura que a fita de rotulagem.
4. Deixe secar por 1 min antes de retirar os espaçadores e puxando os slides separados. A almofada de agar vai ficar com um deles.

Pipeta ~ 10 ul anestésico (2 levamisol mM em tampão M9) para a almofada de transferência e ~ 10 animais utilizando-se uma escolha de fio de platina. Cubra com uma lamela (~ 22 x 22 mm) e tirar fotos dentro de 1 hora.

Alternativamente, para adquirir os filmes ao longo de um longo período de tempo ou para reduzir ainda mais a possibilidade de uma deslocação dos animais, usar uma combinação de anestésico e talão de imobilização ^51.

1. Prepare 10% agaalmofadas aumentou (em tampão M9), conforme descrito ⁵¹ e adicionar minhocas a 3 ul solução padrões de tamanho nanosphere (esferas de poliestireno, 100 nm), mais 3 anestésicos ul (4 levamisol mM em tampão M9). Cubra delicadamente com uma lamela. Para evitar a desidratação, selar a lamínula com valap (mistura de quantidades iguais de vaselina, lanolina e cera de parafina).

Imagem vermes imobilizada utilizando um microscópio confocal.
Nota: Os resultados são obtidos utilizando um disco giratório AF confocal microscópio equipado com uma câmera de EM-CCD e um Software Microscopia Automação e Análise de Imagem, como MetaMorph e delinear os detalhes abaixo, mas outros sistemas de imagem confocal comparável também pode ser usado.

1. Use o objetivo de óleo 63X ou 100X / 1.4NA e coloque a lâmina de microscópio contendo vermes no suporte da lâmina de microscópio.
2. Abra o software. Ajuste de potência do laser e filtros para MRFP imagem. Use o laser 561 nm a 10% de energia e emissão de filtro> 600 nm.
4. Sob a guia "Saving" selecionar ou criar a pasta do diretório onde os arquivos devem ser salvos. Atribua um nome para o arquivo.
5. No separador "Comprimento de onda", selecione a iluminação adequada e ajustar a exposição e ganho. Use "YokoQuad Red" (ou uma configuração de iluminação equivalente para MRFP de imagem) com uma exposição de entre 100 e 300 ms e um ganho da câmera entre 100 e 300, dependendo da amostra individual (avaliada usando a imagem ao vivo).
6. No separador "Timelapse" selecionar "Número de pontos de tempo" = 301, "Duração" = 5 min e "Time / Interval" = 1 seg.
7. Sob a "Journals" tab selecione Journal: "AFC SET Z HOLD" e "AFC Return to Z HOLD", Tipo: &# 8220; Special "(duas vezes), Ponto inicial:" Inicio do horário de ponto "e" Fim do ponto de tempo ". Esta opção de focagem automática é importante para a imagem da mesma secção ao longo de um período mais longo de tempo.
8. Quando a instalação for concluída, pressione "Adquirir". O vídeo timelapse é safed como arquivos TIFF separados.
9. Abra todas ficheiros.tiff de uma determinada série tempo em ImageJ. Vá em "Imagem" → "Stacks" → "Imagens para Stacks". Opcionalmente, ajustar brilho e contraste, adicionar bar tamanho, etc. Exportar o filme em "File" → "salvar como" → "AVI ..." (por exemplo, ver vídeo 1 e 2 correspondente à Figura 1).

2. Usando dobráveis ​​Sensores e Repórteres de estresse para Investigar celular autónomos e não celular Autónoma afeta em Proteostase e Toxicidade

1. Gerar linhagens transgênicas que co-expressar um sensor de dobragem ou estresse reporter em conjunto com a proteína prião semelhante. Para os métodos sobre como estabelecer cruzes ou gerar linhagens transgênicas, ver ^48,49,52. Ver Tabela 1 para uma lista de C. elegans estirpes que podem ser utilizadas.
2. Prepare populações sincronizados de animais transgênicos e cultivá-las até a idade desejada, conforme descrito acima (seção 1.2) ^50.
3. Usando um microscópio estereoscópico, examinar o respectivo fenótipo do sensor de dobragem ou estresse repórter.
   1. Para o sensor de dobragem, determina o número de animais que albergam agregados em cada dia depois da sincronização (por exemplo, ver Figura 2E e F).
   2. Para o repórter tensão, se o ensaio de co-expressão dos resultados priões do tipo de proteína em uma fluorescência aumentada do repórter (para um exemplo, ver Figura 3).

3. Tela Genome-wide para Repressão de toxicidade induzida por Prion em C. elegans

Figura 4. Representação esquemática do protocolo de triagem RNAi. Consulte a seção de protocolo 3 para uma descrição detalhada das etapas individuais.

1. Sincronização de C. vermes elegans e duplicação de biblioteca RNAi
   1. Para a tela de RNAi, usar a biblioteca Ahringer RNAi (ou a biblioteca Vidal RNAi) ^53,54. Rearray a biblioteca de RNAi do original 384 formato bem em placas de 96 poços, preenchendo as placas com 100 ul meio LB-amp (50 ug / ml de ampicilina em LB) suplementado com 10% de glicerol e inocular utilizando um replicador de 96 pinos. Crescer a 37 ° CO / N com agitação e armazenar a -80 ° C.
   2. Manter C. linhagens transgênicas em 20 ° C em placas NGM elegans WT e semeado com OP50 E. bactérias coli de acordo com métodos padrão ^47.
   3. Sincronize transgênico domínio prion e WT (controle) nematóides pelo branqueamento (ver secção 1.2).
   4. No mesmo dia em que os vermes são branqueados, preparar meio LB suplementado com 50 ug / ml de ampicilina. Usar um dispensador automático para distribuir o reagente (ou pipeta manualmente) 65 ul dos meios LB-amp em cada poço de uma placa de 96 poços.
   5. Retirar 96 poços placas biblioteca Ahringer RNAi de -80 ° C e trazê-los para um capuz estéril forrado com papel toalha. Remover imediatamente o selo-tape, segurando a placa de cabeça para baixo, enquanto as placas ainda estão congelados, tendo o cuidado para evitar a contaminação de gelo do lado de fora das placas. Reinverter as placas e deixá-los descongelar por cerca de 30 min.
   6. Mergulhe uma estéril 96 pin replicador em uma placa de RNAi biblioteca, e, em seguida, em uma placa de LB-amp fresco. Use um replicador estéril nova para cada prato. Vede todas as placas com fita adesiva e papel alumínio retornar as placas da biblioteca para -80 ° C. Os replicadores pode ser embebido em água sanitária, enxaguado,e autoclavado para ser usado novamente.
   7. Permitir placas duplicadas de ARNi para crescer O / N em uma incubadora ajustada a 37 ° C e 300 rpm. Para usar HT115 E. coli bactérias que albergam o vector vazio (L4440) como um controlo, crescem-lo separadamente num tubo de cultura e, em seguida, pipeta 65 ul da cultura com uma pipeta de canais múltiplos dentro de um quarto de duas placas de 96 poços.
2. A indução da produção bacteriana ARNcd e adição de vermes
   1. Dilui-Isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) para uma concentração de 5 mM em ddH ₂ O. Utilize uma estação de trabalho automatizada com uma cabeça para dispensar múltiplos canais (ou pipeta manualmente) 10 ul de IPTG diluída em todos os poços das bactérias RNAi e as placas de controlo. Voltar a vedar e colocar as placas de novo na incubadora. Deixá-los agitar durante 3 horas a 37 ° C.
   2. Enquanto as bactérias estão tremendo, preparar os vermes. Misture a suspensão M9 / verme bem, e pipetar uma pequena amostra (~ 5 - 10 ul) para uma lâmina de microscópio de vidro. Contaro número de vermes sob microscópio estereoscópico e calcular o número de vermes por ul.
   3. Utilizando uma técnica estéril, preparar uma solução de M9 suplementado (M9 +) com as seguintes concentrações finais: 0,20 mg / ml de IPTG, 8,0 ug / ml de colesterol, 50 ug / ml de ampicilina, 9,6 ug / ml de tetraciclina, 0,0835 ug / ml de Fungizone, e 15 vermes por 50 ul.
      1. Faça soluções separadas para transgênica domínio prion e vermes WT. O volume final da solução verme M9 + necessária irá depender do número de placas de ARNi copiados (ver abaixo), além de ~ 30 ml de volume morto que vai permanecer no reservatório, se um distribuidor automático é usado.
   4. Após a indução de 3 horas de produção dsRNA bacteriana, tirar as placas fora da incubadora e deixe-os arrefecer à RT (~ 30 min) para evitar calor perturbar os animais.
   5. Dispensar 50 ul de domínio de prião solução verme transgénico M9 + para cada poço das placas de ARNi e uma das placas de controlo do vector vazio. FazerCertifique-se de misturar a solução verme antes de cada passo como os animais tendem a sedimentar para o fundo do reservatório.
   6. Dispensar vermes WT para a segunda placa de controle. Deixar as placas não vedadas para permitir o arejamento. Para manter a cultura líquido evapore, empilhe 4-5 placas juntos e enrole com uma toalha de papel úmido e papel alumínio. Incubar a 200 rpm a 20 ° C durante 4 dias.
3. Scoring
   NOTA: Após 4 dias na incubadora, os vermes estará no segundo dia de vida adulta e estão prontos para o rastreio. Deixe os animais se adaptar às condições não agitam durante 30 minutos antes de triagem para garantir surra sem serem incomodados.
   1. Usando uma câmara Falcon 4M60 ligado a um computador com um monitor, para o aumento da tela visualmente debulha, em comparação com o domínio de prião animais transgénicos de controlo tratados.
   2. Compilar uma lista de visitas preliminares para confirmar usando wrMTrck (veja a próxima seção).

4. Confirmação da PreliminarBatida de tela

1. Ensaio de motilidade em placas sólidas
   1. Preparar placas com NGM suplementadas com 100 ug / ml de ampicilina, 12,5 ug / ml de tetraciclina e 1 mM de IPTG, de acordo com métodos padrão ^47. Se possível, use uma máquina de despejar placa para assegurar todas as placas têm a mesma altura dos meios de comunicação, o que permitirá um processo de aquisição de vídeo mais simplificado.
   2. Crescer as diferentes clones de ARNi em ~ 1 ml de LB + 50 ug / ml de ampicilina, O / N a 37 ° C e 250 rpm.
   3. No dia seguinte, induzir a expressão do ARNcd com IPTG 1 mM durante 3 h. Semente as placas com 150 mL de cada clone bacteriano RNAi, distribuídos em uma camada fina. Deixe as bactérias secas durante 2 dias à TA no escuro. Prepare 3 placas por RNAi clone.
   4. Sincronize a população sem-fim por branqueamento de acordo com métodos padronizados ⁵⁰ (ver secção 1.2), e deixe os ovos eclodem O / N em M9 mídia.
   5. Tomar uma amostra da suspensão verme e determinar a quantidade de NEMatodes por ul no microscópio estereoscópico. Em seguida, pipetar o volume adequado de meio M9 mais vermes em cada placa experimental de modo que contenha 25 - 30 vermes L1. Crescer as nemátodos a 20 ° C durante 4 dias até que os vermes atingir dia 2 da fase adulta.
2. A análise quantitativa da motilidade verme com o plugin wrMTrck para ImageJ
   NOTA: Os vídeos foram gravados usando um microscópio estereoscópico com aumento de 10x com um Hamamatsu Orca-R2 câmera digital C10600-10B eo software PCI imaging Simples Hamamatsu.
   1. Ligue a câmera eo software PCI imagem simples. Clique em "Live" para permitir o ajuste das condições de imagem.
   2. Configurar as condições de vídeo como se segue: Ganho = 0; Modo Luz = alta; Índice de Velocidade = 1; Binning = 2. Clique em "Auto Exposé" e, em seguida, ajustar as condições de iluminação, movendo-se os espelhos microscópio e do brilho e contraste mostradores.
      NOTA: O vídeo precisa ter um alto contraste sem ser OVEREXPosed, de modo que os animais aparecem como formas pretas em um fundo brilhante.
   3. Clique em "Scan Time" e escolha uma pasta e um nome de arquivo. Defina "Campo Delay" para 20 ms e "Pare no Time" a 30 seg. Pressione "Review Live", a fim de escolher a área da chapa para gravar (onde a maioria dos worms são). Toque na placa 3 ou 4 vezes no palco, rapidamente confirmar a sua posição no campo de visão e pressione "Start".
   4. Depois que o filme termina de gravar, clique direito sobre a imagem e escolha "Exportar Montage Sequence" para exportar o filme a partir de um formato .cxd a um .avi.
3. Analisando os vídeos de motilidade
   1. Abra o software ImageJ, vá para a aba "Plugins" e depois em "wrmtrck" e selecione "Batch wrMTrck". Selecione o diretório que contém todos os arquivos a serem analisados.
   2. Na janela de entrada principal do wrMTrck_Batch, carregar os valores de entrada, conforme detalhado na Figure 5C. Explicação para cada um dos parâmetros podem ser encontradas no manual de instruções que acompanham o plugin. Clique em "OK" e deixar a análise do movimento de execução.
   3. Para a curadoria os resultados e confirmar que todas as faixas detectadas são de real C. elegans e eliminar artefatos, abra cada um dos arquivos .txt criados para cada filme e copiar as informações em um arquivo de software de análise de dados. Abra o "* _labels.zip" arquivos criados e executar o que resulta "* _labels.tif" para verificar e eliminar faixas vermes falsos manualmente.

Resultados

Monitoramento intercelular difusão de proteínas príon-like in vivo por time-lapse imaging

Transgênicos C. linhas elegans que expressam o domínio prião são particularmente bem adaptados para a análise de certos aspectos de proteínas priões do tipo, por exemplo, transmissão de célula para célula e a toxicidade celular não autónomo. A transparência dos animais permite o acompanhamento de fluorescente etiquetado proteínas de dentro do organism...

Discussão

Os métodos descritos aqui ajudam a ilustrar espalhando e celular toxicidade autônoma da célula complexo autônomo e não de proteínas príon-like. Descobrimos recentemente que um domínio de prion cytosolic agregação propensas é retomado em vesículas ligadas à membrana em um processo de autofagia relacionados. Um subconjunto específico dessas vesículas transporta o domínio de prião dentro e entre as células e tecidos ^40. A chave para controlar o seu movimento no animal vivo é que a proteína tem de ser marcado com...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
reagentes
100 nm	ThermoScientific	3100A
Levamisol	Sigma	L-9756
IPTG	Sigma	15502-10G
Ahringer RNAi library	Fonte: BioScience LifeSciences		http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipamento
Centrífuga Refrigerada Sorvall Legend XTR, 120VAC	ThermoScientific	75004521	http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60
Replicador de 96 pinos	Scionomix		http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
Agitador de incubação de alta capacidade HiGro		Multidrop Digilab
	Titertrek		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96	Beckman Coulter		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Shaker Innova44	New Brunswick		http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04& ação=produtos& contentid=1& catalognode=83389
M205 FA	Leica		http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDicidade CCD	Câmera Hamamatsu		http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Microscópio Confocal	Câmera Leica		http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60	Teledyne Dalsa		http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopia Automação & Software de Análise de Imagem	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu Software de Análise de Imagem SimplePCI	Meyer Instruments		http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ	NIH		http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrPlugin MTrck para ImageJ			http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans cepas
N2 (WT)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                                                                      rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]		Morimoto	disponível em nosso laboratório
Consulte a tabela 1 para obter uma fonte para deformações