Overflade Potentiel Måling af Bakterier Brug Kelvin Probe force mikroskopi

Summary

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Abstract

Surface potentiale er en almindeligt overset fysisk egenskab, som spiller en dominerende rolle i vedhæftningen af ​​mikroorganismer til substrat overflader. Kelvin sonde force mikroskopi (KPFM) er et modul af atomic force mikroskopi (AFM), der måler kontakten potentielle forskel mellem overflader på nanoskala. Kombinationen af ​​KPFM med AFM giver mulighed for samtidig generering af overfladen potentiale og topografiske kort af biologiske prøver, såsom bakterieceller. Her beskæftiger vi KPFM at undersøge effekten af ​​overfladen potentiale på mikrobiel adhæsion til medicinsk relevante overflader såsom rustfrit stål og guld. Surface potentielle kort afslørede forskelle i overfladen potentiale for mikrobielle membraner på forskellige materielle substrater. En trin-højde graf blev genereret for at vise forskellen i overfladen potentiale ved en grænse området mellem substratoverfladen og mikroorganismer. Ændringer i cellemembranen overflade potentiale har været forbundet med forandrings i cellulær metabolisme og motilitet. Derfor KPFM repræsenterer et kraftfuldt værktøj, der kan anvendes til at undersøge ændringer i mikrobiel membranoverflade potentiale upon vedhæftning til forskellige substratoverflader. I denne undersøgelse viser vi proceduren karakterisere de potentielle individuelle methicillinresistente Staphylococcus aureus USA100 celler overflade på rustfrit stål og guld ved hjælp KPFM.

Introduction

Biofilm produceres på udstyr overflader og i kutane sår udgør et problem for den medicinske industri som biofilm er genstridige til fjernelse og kan føre til en større procentdel af overførsel af sygdomme og antibiotikaresistens. Attachment er det første skridt i biofilm dannelse og er den mest kritiske trin på grund af sin reversible ^1-3. Substratoverfladen egenskaber spiller en afgørende rolle på mikrobiel fastgørelse. Faktorer såsom overfladehårdhed, porøsitet, ruhed og hydrofobicitet er blevet vist at bevirke mikrobiel fastgørelse; har imidlertid lidt forskning undersøger rolle substratoverfladen potentiale (SP) på mikrobiel adhæsion blevet gjort ^4,5. Negativt ladede overflader forhindrer fastgørelsen af Bacillus thuringiensis sporer til glimmer, silicium, og guld ^6. Ændringer i cellulær membranpotentiale er tegn på ændringer i cellulær vedhæftning og motilitet ^5,7. Det er blevet observeret, at elektrisk homogeneous overflader lettere fremmer mikrobiel vedhæftning ^5. Karakterisering af potentialet af bakterier overflade i nanoskala kan tilvejebringe en hidtil ukendt måde at forstå vedhæftning kinetik af bakterier til forskellige overflader, og dermed kan bidrage i udviklingen af ​​anti-biofouling strategier. I modsætning til andre metoder til karakterisering af elektro kinetik bakterier, såsom elektroforetisk lysspredning, zeta potentiale, og isoelektriske punkt beslutsomhed, Kelvin sonde force mikroskopi (KPFM) giver mulighed for undersøgelse af de enkelte celler i stedet for hele kulturer ^8-11. Det er en fordel, når der ønsker at sammenligne celle-celle eller biofilm elektriske egenskaber med stor nøjagtighed og præcision.

KPFM er et modul af atomic force mikroskopi (AFM). AFM blev udviklet som et direkte resultat af scanning tunneling mikroskop (STM) ^12. De første offentliggjorte billeder ved hjælp af STM blev udført af Gerd Binnig og Heinrich Rorhrer i 1982 ¹² </sup>. Deres opfindelse var i stand til at løse atomare strukturer ved raster scanne en skarp ledende spids over en ledende overflade i luften. Konsekvenserne af at opnå billeder i høj opløsning ophidset biologer, der hurtigt forsøgt at bruge SMS til billedet tørrede prøver af DNA, proteiner og virus ^12. STM kan også ske i væsker ved hjælp af specialiserede probespidser ^13. Dette blev vist ved Lindsay et al., Der brugte STM og AFM til billedet DNA-molekyler i 10 mM _HCIO4 og i vand, på guldelektroder ^13. KPFM er blevet påvist i fastlæggelsen af Surface potentialer DNA og protein analyse ²⁵ og biomolekyler interaktion med ligander ^26.

KPFM fungerer ved at måle kontakt potentielle forskel (CPD) mellem en AFM ledende cantilever spids og ideelt ledende prøve (figur 1, i) ^14,15. Prøver behøver ikke nødvendigvis at være ledende (dvs. biologisk samples). Imaging kan udføres på glimmer, glas og silicium overflader (ikke-ledende), så længe den ikke-ledende overflade er tynd, og der er et underliggende ledende materiale ^6,7. Byggevaredirektivet svarer til overfladen potentielle spænding og kan beskrives som forskellen i arbejdsfunktionerne mellem spidsen (φ _tip) og prøve (φ _prøve), divideret med den negative elektron ladning (- e). Når en ledende AFM spids bringes tæt på en prøve overflade (adskilt af afstanden d), en elektrostatisk kraft (F _ES) genereres på grund af forskellen i Fermi energi (figur 1, II, a) ^15. På dette tidspunkt vakuum energier spidsen og prøven (E _V) er i ligevægt og tilpasset. Ved at bringe spidsen tættere på prøveoverfladen, spidsen og prøvens overflade kommer i elektrisk kontakt og fungerer som parallelle plade kondensatorer (figur 1, II, B </strong>) ^14,15. På det sted, Fermi energier spidsen og prøveoverfladen blive justeret, nå steady state ligevægt (figur 1, II, b). Spidsen og prøve overflade vil blive opkrævet og en V _CPD vil danne grund af en forskel i E _mod 's og arbejdsfunktioner. En F _es virker på den elektriske kontakt området på grund af den dannede V _CPD. Denne kraft efterfølgende ophævet ved anvendelse af en ekstern V _DC til spidsen, der har samme størrelse som den dannede V _CPD (figur 1, II, C). Det gjaldt jævnspænding eliminerer overfladeladning på området elektrisk kontakt, og mængden af V _DC nødvendigt at fjerne de F _es i V _CPD er lig med forskellen i arbejdsfunktionerne mellem sample overflade og drikkepenge ^15. Det skal bemærkes, at arbejdsfunktionen af ​​spidsen kendes, og det leveres af fabrikanter. I alle KPFM metoder, en AC spænding (V _AC, ca. 100-500 mV) anvendes også til spidsen for at generere oscillerende elektriske kræfter mellem spidsen og prøve ^14. Dette giver en bedre opløsning, når måling af ændringer i V _CPD og / eller F _es. I denne henseende kan ændringer i frekvensen eller amplituden af elektrisk oscillation korrigeres ved V _DC, og overflade potentielle kort kan genereres. Data fra bestemte områder af disse kort kan analyseres yderligere for at give elektrisk oplysninger om specifikke topografiske funktioner.

KPFM kan betjenes i tre tilstande: (1) lift tilstand, (2) amplitude modulation (AM) tilstand, og (3) frekvens modulation (FM) tilstand ^14,16. Lift-funktion var den oprindelige incarnation af KPFM. Lift tilstand er afhængig af en to-pass metode, hvor en oscillerende spids trækkes hen over overfladen for at opnå et topografisk billede. For den anden passage spidsen hæves en forudindstillet afstand over prøven (10-100 nm) og scannet tilbage over det samme område. På grund af denne to-pass metode, elevator tilstand i forhold til AM- og FM-KPFM, tager længst tid for billedoptagelse. Raising spidsen væk fra overfladen sikrer, at kun langtrækkende F _ES måles. Også, krydstale mellem topografi og overflade potentielle målinger afkoblet på bekostning af øget lateral opløsning og følsomhed.

AM-KPFM forbedrer lateral opløsning og følsomhed ved at bruge dobbelt-frekvenser til samtidig prøve topografi og overflade potentiale (one-pass scanning) ^14. I AM-modus, er cantilever mekanisk oscilleres, generelt 5% under den første resonansfrekvens (f _0), og elektrisk svinget (through en V _AC) ved sin anden resonansfrekvens (f _1). Ændringer i amplituden af f ₀ føring til generering af topografiske data, mens ændringer i amplituden af f _1, som følge af ændringer i F _es og V _CPD, giver overfladen potentielle måledata. f ₀ og f ₁ af cantilever er adskilt af betydelige frekvenser og energier, der signalerer krydstale minimeres ^14. Feltet hoved elektronik (HEB) i AFM adskiller de to signaler til at give både topografisk og overflade potentielle data samtidigt i én scanning. FM-KPFM forbedrer opløsning endnu videre end AM-KPFM på biologiske overflader ^14. FM-KPFM virker anderledes end AM-KPFM i, at det måler ændringer i elektrostatiske kraft gradienter snarere end elektrostatisk kraft (F _es) ^15. Ligesom AM-tilstand, FM-tilstand udnytter dual-frekvenser og en enkee-pass scanning mekanisme til at opnå topografiske og overflade potentielle data samtidigt ^14. I FM-tilstand, er cantilever mekanisk oscilleres på f ₀ og elektrisk oscilleres ved en lav modificeret frekvens (f _mod, typisk 1-5 kHz). Ved elektrostatiske interaktioner, at f ₀ og f _mod mix producere sidebånd f ₀ ± f _mod. Disse sidebånd er meget følsom over for ændringer i elektrostatisk kraft, og kan adskilles fra f ₀ gennem AFM s HEB. Da FM-KPFM måler ændringer i elektrostatiske kraft gradienter, spille tips apex form og dens vedligeholdelse / integritet en kritisk rolle for den overflade potentiel opløsning ^{14, 15.} Surface potentiel opløsning med AM og FM-indstillinger i intervallet 1 nm til siden ^{14 -16.} Det skal bemærkes, at KPFM billeddannelse kan ske i ikke-polære væsker, og har vist sig for nylig at blive gjort i lav-ionisk (<10 mm) polære væsker (iåben sløjfe KPFM tilstande, som ikke kræver en bias feedback, hvorved man undgår anvendelse af en DC bias), såsom MilliQ vand; Men KPFM billedbehandling endnu skal gøres på levende celler i polære løsninger ^17-20. Yderligere udfordringer forbundet med SP billeddannelse i væske er, at løsninger der almindeligvis anvendes til at opretholde celler (dvs. phosphatpufret saltvand) har høje koncentrationer af mobile ioner, hvilket vil føre til Faradaic reaktioner, bias-induceret charge dynamik og iondiffusion / omfordeling ^20. Således for dette eksperiment blev målinger taget fra tørrede og døde MRSA celler på poly-L-lysin funktionaliserede rustfrit stål og guld overflader under omgivelsesbetingelser. Imaging kan udføres i luft eller vakuum på biologiske prøver, der tidligere er blevet tørret eller immobiliseret på overflader ^20. Fugtige forhold har også vist sig at påvirke KPFM billeddannelse af overflader ^6.

I denne undersøgelse anvendte vi FM-KPFMog AFM at undersøge, hvilken rolle SP om udlæg i methicillin-resistente Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) til poly-L-lysin funktionaliserede rustfrit stål og guld overflader. MRSA har for nylig vundet status som en multi-lægemiddelresistente (MDR) "superbug" på grund af dets naturligt valgt resistens over for mange β-lactam-antibiotika og cephalosporiner ^21. MRSA infektioner er nu mere udfordrende, vanskelig og formidable til behandling, hvilket fører til anvendelse af hårdere antimikrobielle såsom vancomycin eller oxazolidinoner, der har højere toksicitet i mennesker, og kan derfor ikke anvendes som langsigtede behandlinger ^22. Rustfrit stål blev valgt på grund af sin medicinsk relevans og fælles brug som materiale i kanyler, bækkener, dørhåndtag, dræn osv Guld blev anvendt som en sammenlignende metal. FM-KPFM blev anvendt til at undersøge, om mikrobiel membran SP ændringer efter binding til substraterne.

Protocol

1. Fremstilling af glas og kulturer Før du fortsætter med dette forsøg, forberede 5% får blod agar (SBA) plader til dyrkning MRSA. Inkuber SBA plader i 24 timer ved 37 ° C. Efter dette tidspunkt bør enkelt, godt isolerede kolonier være til stede for at blive anvendt til efterfølgende inokulationer i flydende medier. Store stribede SBA plader med enkelt kolonier ved 4 ° C i 1 – 2 måneder. BEMÆRK: fåreuld blodagarplader kommer i pre-made pakker med mellem 20-25 plader på grundlag af producen…

Representative Results

Evnen til at måle SP hjælp KPFM bygger på princippet om, at både prøvens overflade og cantilever spids er ledende til en vis grad. Rustfrit stål og guld fungerede som ledende overflader, som MRSA til igen. KPFM billeder blev taget af 15 MRSA-celler på begge flader med 512 x 512 resolutioner, og med scan områder lige fra 5 x 5 um til 10 x 10 um. Scanning blev udført med line hastigheder fra 0,02 linjer / sek til 0,05 linjer / sek. Derfor, med 512 datapunkter indsamlet pr linje og 512 linjer til at scanne, scan g…

Discussion

KPFM var ansat som ny teknik til at opnå overflade elektriske data. Det har været almindeligt anvendt som en metode til at undersøge ladningsfordeling i kemi og er først for nylig begyndt at blive anvendt til studiet af biologiske systemer på mikro- og nano-skalaer. Fra de indsamlede data, vi fandt, at mikrober ikke synes at let vedhæfte at rengøre rustfrit stål og guld overflader, selv efter 3 timer af statisk inkubation. Poly-L-lysin funktionaliserede overflader viste hurtig mikrobiel vedhæftning efter 30 min…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.  We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder.  Instruction on how to make come on the container.