Ytpotential Mätning av bakterier Använda Kelvin Probe Force Microscopy

Summary

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Abstract

Ytpotential är ett vanligt förbi fysisk egenskap som spelar en dominerande roll i vidhäftningen av mikroorganismer till substrat ytor. Kelvin probe kraft mikroskopi (KPFM) är en modul för atomkraftsmikroskopi (AFM) som mäter kontaktpotentialskillnaden mellan ytorna på nanoskala. Kombinationen av KPFM med AFM möjliggör samtidig produktion av ytan potential och topografiska kartor över biologiska prover, såsom bakterieceller. Här använder vi KPFM att undersöka effekterna av ytpotential på mikrobiell vidhäftning till medicinskt relevanta ytor som rostfritt stål och guld. Ytpotential kartor avslöjade skillnader i ytpotential för mikrobiella membran på olika materialsubstrat. Ett steg-höjd graf alstrades för att visa skillnaden i ytpotential vid en gräns område mellan substratytan och mikroorganismer. Förändringar i cellmembranytan potential har kopplats med förändringsi cellulär metabolism och motilitet. Därför KPFM utgör ett kraftfullt verktyg som kan användas för att undersöka förändringar av mikrobiell membranyta potential vid vidhäftning till olika substratytor. I denna studie visar vi proceduren att karaktärisera ytpotentialen för individuella MRSA USA100 celler på rostfritt stål och guld med hjälp KPFM.

Introduction

Biofilmer produceras på utrustningsytor och kutana sår presentera ett problem för den medicinska industrin som biofilmer är motsträviga till avlägsnande och kan leda till ökade priser för överföring av sjukdomar och antimikrobiell resistens. Attachment är det första steget i biofilmbildning och är det mest kritiska steget på grund av sin reversibilitet ^1-3. Substrat ytegenskaper spelar en avgörande roll på mikrobiell fastsättning. Faktorer som ythårdhet, porositet, råhet, och hydrofobicitet har visat sig påverka mikrobiell fastsättning; har dock lite forskning undersöker vilken roll substratytan potential (SP) på mikrobiell vidhäftning gjorts ^4,5. Negativt laddade ytorna för att förhindra vidhäftningen av Bacillus thuringiensis sporer på glimmer, kisel och guld ^6. Förändringar i cellmembranpotential indikerar förändringar i cellulär infästning och motilitet ^5,7. Det har observerats att elektriskt homogeneous ytor främjar lättare mikrobiell vidhäftning ^5. Characterizing ytpotentialen av bakterier i nanoskala kan tillhandahålla ett nytt sätt att förstå vidhäftnings kinetiken av bakterier på olika ytor, och därigenom kan hjälpa till vid utvecklingen av anti-Påväxt strategier. Till skillnad från andra metoder som används för att karakterisera de elektro kinetik bakterier, såsom elektroljusspridning, zeta-potential, och isoelektrisk punkt beslutsamhet, Kelvin probe kraft mikroskopi (KPFM) möjliggör för undersökning av enskilda celler i stället för hela kulturer ^8-11. Detta är fördelaktigt när man vill jämföra cell-cell eller biofilm elektriska egenskaper med hög noggrannhet och precision.

KPFM är en modul av atomkraftsmikroskopi (AFM). AFM utvecklades som ett direkt resultat av sveptunnelmikroskop (STM) ^12. De första publicerade bilder med STM gjordes av Gerd Binnig och Heinrich Rorhrer 1982 ¹² </sup>. Deras uppfinning kunde lösa atomstrukturer med raster skanna en skarp ledande spets över en ledande yta i luft. Konsekvenserna av att uppnå högupplösta bilder upphetsad biologer som snabbt försökte använda STM till bild torkade prover av DNA, proteiner och virus ^12. STM kan också göras i vätskor med hjälp av specialiserade probspetsar ^13. Detta visades av Lindsay et al., Som använde STM och AFM till bild DNA-molekyler i 10 mM _HCIO4 och i vatten, på guldelektroder ^13. KPFM har visats i fastställandet av ytpotentialer av DNA och proteinanalys ²⁵ och biomolekyler interaktion med ligander ^26.

KPFM fungerar genom mätning av kontaktpotentialskillnaden (CPD) mellan ett AFM ledande fribärande spets och en idealt ledande prov (Figur 1, i) ^14,15. Prover behöver inte nödvändigtvis vara ledande (dvs biologiskt samples). Imaging kan utföras på glimmer, glas och kiselytor (icke-ledande) så länge som den icke-ledande ytan är tunn och det finns en underliggande ledande material ^6,7. CPD motsvarar ytpotentialen spänning och kan beskrivas som skillnaden i arbetsfunktioner mellan spetsen (φ _spets) och prov (φ _prov), dividerat med negativ elektronladdningen (- e). När ett ledande AFM spets bringas nära en provyta (separerade med avståndet d), en elektrostatisk kraft (F _es) alstras på grund av skillnaden i Fermi energier (figur 1, ii, a) ^15. Vid denna punkt, vakuum energier spetsen och provet (E _v) är i jämvikt och inriktade. Vid föra spetsen närmare till provytan, spetsen och provytan kommer i elektrisk kontakt och fungerar som parallella plattkondensatorer (Figur 1, II, b </strong>) ^14,15. Vid punkten, de Fermi energier spetsen och provytan blir i linje, nå en steady-state jämvikts (Figur 1, ii, b). Spetsen och provytan kommer att debiteras och en V _CPD bildas på grund av en skillnad i E _v s och arbetsfunktioner. En F _es verkar på den elektriska kontaktytan på grund av den bildade V _CPD. Denna kraft därefter upphävs genom tillämpning av en yttre V _likström till spetsen som har samma storleksordning som den bildade _V-CPD (Figur 1, ii, c). Detta gällde likspänning eliminerar ytladdning inom elektriska kontakten, och mängden V _DC nödvändigt att undanröja de F _es i V _CPD är lika med skillnaden i arbetsfunktioner mellan sample ytan och spetsen ^15. Det bör noteras att den arbetsfunktion hos spetsen är känd och det tillhandahålls av tillverkare. I alla KPFM metoder, en växelspänning (V _AC, ca 100-500 mV) matas också till spetsen för att alstra oscillerande elektriska krafter mellan spetsen och provet ^14. Detta ger bättre upplösning vid mätning förändringar i V _CPD och / eller F _es. I detta avseende kan förändringar i frekvens eller amplitud av elektrisk svängning korrigeras genom V _DC, och ytpotential kartor kan genereras. Data från specifika områden av dessa kartor kan analyseras vidare för att tillhandahålla elektrisk information om specifika topografiska egenskaper.

KPFM kan köras i tre lägen: (1) lyftläge, (2) amplitudmodulering (AM) läget, och (3) frekvensmodulering (FM) mod ^14,16. Lyft läget var den initiala incarnation av KPFM. Lyftmod förlitar sig på en två-pass-metod, i vilken en oscillerande spets dras över ytan för att erhålla en topografisk bild. För den andra passagen spetsen höjs ett förinställt avstånd ovanför provet (10-100 nm) och scannas tillbaka över samma område. På grund av denna två-pass metoden, lyftläge, jämfört med AM och FM-KPFM, tar längst tid för bildtagning. Raising spetsen bort från ytan säkerställer att endast långväga F _es mäts. Dessutom är överhörning mellan topografi och ytpotential mätningar frikopplade på bekostnad av ökad upplösning och känslighet sidled.

AM-KPFM förbättrar lateral upplösning och känslighet genom att använda dubbla frekvenser att samtidigt mäta provets topografi och ytpotential (one-pass scan) ^14. I AM mod är fribärande mekaniskt pendlat, vanligtvis 5% under sin första resonansfrekvens (f _0), och elektriskt pendlade (through en V _AC) vid sin andra resonansfrekvensen (f _1). Förändringar i amplitud f ₀ leder till generering av topografiska data, medan förändringar i amplitud f _1, på grund av förändringar i F _es och V _CPD, ge potentiella mätdata yta. f ₀ och f ₁ av konsolen är åtskilda av betydande frekvenser och energier som signalerar överhörning minimeras ^14. Chefen elektronikbox (HEB) av AFM skiljer ut de två signalerna för att ge både topografiska och ytpotentialen uppgifter samtidigt i en skanning. FM-KPFM förbättrar upplösningen ännu längre än AM-KPFM på biologiska ytor ^14. FM-KPFM fungerar annorlunda än AM-KPFM genom att den mäter förändringar i elektrostatisk kraft lutningar snarare än elektrostatisk kraft (F _es) ^15. Liksom AM mod, använder FM-läge dubbla frekvenser och en single-pass skanning mekanism för att få topografiska och ytpotential data samtidigt ^14. I FM-läge är fribärande mekaniskt pendlat vid f ₀ och elektriskt pendlat på en låg modifierad frekvens (f _mod, vanligtvis 1 – 5 kHz). Vid elektrostatiska interaktioner, f ₀ och f _mod mix att producera sidband f ₀ ± f _mod. Dessa sidobanden är mycket känsliga för förändringar i elektrostatisk kraft, och kan separeras från f ₀ genom AFM: s HEB. Eftersom FM-KPFM mäter förändringar i elektrostatisk kraft gradienter, det tips apex form och dess underhåll / integritet spelar en avgörande roll för den globala ytpotential upplösning ^{14, 15.} Ytpotential upplösning med AM och FM lägen är i intervallet 1 nm sidled ^{14 -16.} Det bör noteras att KPFM avbildning kan ske i icke-polära vätskor, och mer nyligen, har visat sig ske i lågt joniska (<10 mM) polära vätskor (iopen-loop KPFM lägen som inte kräver en bias återkoppling, vilket undanröjer tillämpning av en DC bias) såsom MilliQ vatten; Men KPFM avbildning har ännu göras på levande celler i polära lösningar ^17-20. Ytterligare utmaningar förknippade med SP avbildning i vätskan är att lösningar som vanligen används för att upprätthålla celler (dvs, fosfatbuffrad saltlösning) har höga koncentrationer av mobila joner, vilket skulle leda till faradisk reaktioner, sned-inducerad laddningsdynamik och jondiffusion / omfördelning ^20. Således för detta experiment gjordes mätningar av torkade och döda MRSA celler på poly-L-lysin funktion stål och guld ytor av rostfritt under omgivningsförhållanden. Imaging kan utföras i luft eller vakuumförhållanden på biologiska prover som tidigare har torkat eller immobiliserade på ytor ^20. Fuktiga förhållanden har också visats påverka KPFM avbildning av ytor ^6.

I denna studie använde vi FM-KPFMoch AFM att undersöka betydelsen av SP om kvarstad på MRSA USA100 (MRSA) till poly-L-lysin funktion rostfritt stål och guldytor. MRSA har nyligen rönt status som en multiresistent (MDR) "superbug" på grund av sin naturligt utvald resistens mot många β-laktamantibiotika och cefalosporiner ^21. MRSA-infektioner är nu mer utmanande, svårt och formidabelt att behandla, vilket leder till användning av hårdare antimikrobiella såsom vankomycin eller oxazolidinoner som har högre gifthalter hos människor, och kan därför inte användas som långtidsbehandling ^22. Rostfritt stål valdes på grund av dess medicinska relevans och gemensam användning som material i injektionsnålar, bäcken, dörrhandtag, diskbänkar, etc. Guld användes som ett jämförande metall. FM-KPFM användes för att undersöka om mikrobiell membran SP ändras vid montering på substraten.

Protocol

1. Beredning av Glas och kulturer Innan detta experiment, förbereder 5% fårmjölk blodagar (SBA) plattor för växande MRSA. Inkubera SBA plattorna under 24 h vid 37 ° C. Efter denna tid bör enkel-, välisolerade kolonier vara närvarande för att användas för efterföljande vaccinationer i flytande medier. Butiks strimmig SBA-plattor med enstaka kolonier vid 4 ° C under 1-2 månader. OBS: fårblod agarplattor kommer i färdiga förpackningar innehållande mellan 20-25 plattor baserade på tillv…

Representative Results

Förmågan att mäta SP använder KPFM bygger på principen att både provytan och fribärande spets är ledande i viss utsträckning. Rostfritt stål och guld agerade som ledande ytor på vilka MRSA fästes. KPFM bilder togs av 15 MRSA celler på båda ytorna med 512 x 512 upplösning och med skannings områden från 5 x 5 pm till 10 x 10 um. Scanning genomfördes med linjehastigheter som sträcker sig från 0,02 linjer / sek till 0,05 linjer / sek. Därför, med 512 datapunkter samlas per linje och 512 rader för att …

Discussion

KPFM var anställd som en ny teknik för att få ytan elektriska data. Det har ofta använts som en metod för att undersöka laddningsfördelning i kemi och har först nyligen börjat tillämpas för att studera biologiska system på mikro- och nano skalor. Utifrån de uppgifter som samlats in fann vi att mikrober inte verkade lätt fästa till rent stål och guld ytor av rostfritt, även efter 3 h av statisk inkubation. Poly-L-lysin funktion ytor uppvisade snabb mikrobiell fastsättning efter 30 min. Längre inkubatio…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.  We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder.  Instruction on how to make come on the container.