Isoleringen af individuelle dopaminneuroner eller ventrale tegmentalområde med direkte eller indirekte immunhistokemi påvises ved hjælp af laser capture mikrodissektion. Parametre til isolering af væv fra et objektglas under anvendelse af en infrarød laser og fra membran- slides anvendes en kombination af en infrarød og ultraviolet laser diskuteres.
Laser capture microdissection (LCM) anvendes til at isolere en koncentreret population af individuelle celler eller præcise anatomiske områder af væv fra vævssnit på et objektglas. Når det kombineres med immunohistokemi kan LCM anvendes til at isolere individuelle celler typer baseret på et specifikt protein markør. Her LCM teknikken beskrevet for indsamling af en specifik population af dopaminneuroner direkte mærket med tyrosin hydroxylase immunohistokemi og til isolering af dopamin neuron indeholdende region af det ventrale tegmentale område ved indirekte tyrosinhydroxylase immunhistokemi på en del støder op til dem, der anvendes til LCM. Et infrarødt (IR) capture laser bruges til både dissekere individuelle neuroner samt ventrale tegmentalområde off objektglas og på en LCM hætte til analyse. Fuldstændig udtørring af vævet med 100% ethanol og xylen er kritisk. Kombinationen af IR capture laser og ultraviolet (UV) cutting laser bruges til at isolere individuelle dopaminneuroner eller ventrale tegmentalområde når pennen membran slides. En PEN membran slide har betydelige fordele i forhold et objektglas, da det giver bedre sammenhæng i at fange og indsamle celler, er hurtigere at indsamle store stykker væv, er mindre afhængig af dehydrering og resulterer i fuldstændig fjernelse af væv fra slide. Selv om fjernelse af store områder af væv fra et objektglas er muligt, er det betydeligt mere tidskrævende og ofte efterlader nogle resterende væv bag. Data, der er vist her viser, at RNA af tilstrækkelig mængde og kvalitet kan opnås ved hjælp af disse procedurer for kvantitativ PCR målinger. Selv RNA og DNA er de mest almindeligt isolerede molekyler fra væv og celler opsamlet med LCM, isolation og måling af microRNA, protein og epigenetiske ændringer i DNA kan også drage fordel af den forbedrede anatomiske og cellulær opløsning opnået ved anvendelse af LCM.
Alle væv består af en heterozygot population af celler. Dette er særlig relevant for hjernevæv, der består af forskellige morfologisk og / eller neurochemically distinkte neuroner omgivet af forskellige typer af gliaceller (oligodendrocytter, mikroglia og astrocytter). Derudover adskilte regioner i hjernen, såsom områder af cortex eller hjernestammen kerner, har specifikke funktioner. Derfor er evnen til at isolere specifikke populationer af celler eller meget små anatomisk særskilte områder, når de kombineres med analytiske teknikker (dvs., Q-PCR, microarrays, RNA-sekventering, og proteomics), kan markant øge forståelsen af forskellige biologiske processer. LCM er en teknologi, der giver mulighed for at isolere meget diskrete anatomiske områder eller specifikke celler fra væv på et objektglas giver en meget mere homogen kilde til yderligere analyse af forskellige molekyler, såsom RNA, microRNA, DNA og proteiner.
t "> Eftersom LCM blev indført, har flere forskellige fremgangsmåder blevet anvendt til at microdissect celler fra væv 1-3. De tidligste metoder omfattede direkte fastgørelse af væv på et objektglas ved anvendelse af en infrarød (IR) laser, og en termoplastisk film og et ikke- kontakt under anvendelse af en ultraviolet (UV) skæring laser at frigøre en celle eller væv og samling i et rør. Efterfølgende LCM held har været anvendt på en lang række væv og celletyper og vist sig at være forenelige med isolation af forskellige molekyler for downstream analyse herunder RNA, microRNA, DNA og proteiner, herunder enzymatisk aktivitet 1,4-7. Her LCM demonstreres ved hjælp af et LCM, som anvender et skærende UV laser og en capture IR laser til at skære omkring celler eller væv og vedhæfter den til en LCM cap, henholdsvis. Dette LCM system anvender både IR capture laser til at smelte en plastfilm på en hætte over cellen eller væv af interesse, der lægger cellerne til plastfolien og fjerner det fra than væv med fjernelse af hætten (figur 1). Derudover, i kombination med IR-laser, en UV-laser er tilgængelig til at skære ud væv eller celler af interesse fra væv monteret på objektglas med en membran og derefter isoleret ved fastgørelse af væv til LCM hætten ved hjælp af IR-laser (figur 2). En kort oversigt over disse teknikker findes i figur 1 og 2.Adskillige variationer af denne teknik er beskrevet enten isolere specifikke celler ved hjælp af direkte fluorescerende immunohistokemi og en indirekte immunhistokemi-guided teknik, der anvendes til isolering af et område af væv baseret på ekspressionen af et specifikt protein. Specifikt isolering af dopamin neuroner fra substantia nigra og isolering af den ventrale tegmentale område og efterfølgende isolering af RNA fra friske, frosne hjernevæv vist. RNA er den mest labile molekyler målt (i forhold til DNA eller protein), stEPS for at bevare RNA integritet er inkluderet og data vises på mængden og kvaliteten af RNA opnået.
LCM er en kraftfuld teknik til dissektion af diskrete populationer af celler eller områder af væv fra vævssnit på et mikroskopobjektglas, og den efterfølgende isolering af RNA, microRNA, DNA og proteiner. Anvendelsen af LCM i kombination med analyse under anvendelse af high-throughput teknologier såsom microarray, næste generation RNA sekventering, epigenetisk analyse af DNA og proteomics bliver mere og mere almindelige, som følsomheden af disse teknikker forbedrer og mængden af udgangsmateriale nødvendige reduceres 8-12. Med LCM, er en bedre anatomisk opløsning opnået for en prøve, og den forståelse fra downstream foranstaltninger af disse prøver er stærkt forbedret. En advarsel med LCM er, at det giver en koncentreret prøve af cellerne af interesse, men ikke nødvendigvis en ren population af celler. Grænserne for præcision betyder, at der vil være nogle urenheder fra tilstødende væv. Denne teknik har dog koncentrere cellerne af interesseat minimere virkninger forbundet med omgivende væv og celler og maksimere de eksperimentelle virkninger på cellerne af interesse.
Direkte versus indirekte Immunohistokemi
Da LCM øjeblikket anvendes primært til isolering og måling af RNA, holde RNA intakt er et meget vigtigt kriterium. Fastholdelse RNA integritet er det vigtigste rationale bag anvendelsen af indirekte immunohistokemi til at lede væv dissektion, som fjerner nødvendigheden af at plette vævet direkte som kan nedbryde RNA (figur 10). Når den eksperimentelle spørgsmål, kræver imidlertid isolering af en specifik population af celler, såsom dopamin neuroner er direkte fluorescerende immunhistokemi påkrævet. Ved hjælp af en hurtig immunhistokemi mærkning protokol kan minimere nedbrydningen af RNA under proceduren. De korte inkubationstider skyldes anvendelsen af høje koncentrationer af primære og sekundære antiorganer, koncentrationer, der er omkring 10-20 gange højere end hvad der er nødvendigt for konventionel immunhistokemi med en 2 timers inkubation. Hvis imidlertid længere inkubationstider påkrævet, Brown og Smith brugte højt saltindhold buffere til at hæmme RNA-nedbrydning og få god kvalitet RNA med lange inkubationstid (op til 20 timer) 13. Denne fremgangsmåde kan også anvendes, hvis der er en betydelig tid, der kræves mellem mærkning af vævet og få adgang til en LCM system.
Valg af dias – PEN membran, Silan-prep og ikke-coatede objektglas
Anvendelsen af ikke-coatede objektglas for LCM er blevet rapporteret 14. I vores laboratorium har Silan-prep slides vist sig at være et optimalt valg, da denne belægning er tilstrækkelig lægger vævet til objektglasset for immunhistokemi uden tab af væv, men stadig giver mulighed for fastgørelse af væv til LCM CAPS og fjernelse fra slide . Ikke-coatede objektglas harviste nogle væv tab med immunhistokemi procedure. Hvis der anvendes indirekte immunhistokemi imidlertid bliver væv tilbageholdelse mindre af et problem. Med korrekt dehydrering, opfange celler eller væv ud af Silan-prep dias har ikke været et problem. Hver af de forskellige tilgange til isolering neuroner eller hjerneområder, der er beskrevet i dette dokument har fordele og ulemper. Til isolering af individuelle dopaminneuroner, anvendelse silan-prep slides har den fordel, bedre optik og er billigere end PEN membran slides. Ulempen er, at nogle gange fange celler kan være vanskeligt, hvis der ikke er tilstrækkelig dehydrering (se nedenfor), og nogle væv kan efterlades på dias. Fordelen af pennen membraner slides er, at der anvendes en kombination af IR-laser og UV-laser sikrer, at dopaminneuroner vil blive indsamlet. Manglende indsamle celler fra en pen membran glider næsten aldrig forekommer, da det er mindre afhængig af dehydrering end objektglas. En yderligere fordel er, at UV-laser kan anvendes til tættere tilnærmelse formen af neuroner af interesse, sammenlignet med en cirkel for at opfange neuroner ud af objektglas med IR laser. Til isolering af områder af væv, de PEN membran dias er langt overlegen og retfærdiggøre den ekstra omkostning. Denne metode resulterer i fuldstændig fjernelse af alt væv skåret ud på membranen, er meget hurtigere end opfange et stort område af væv ved hjælp af IR-laser alene og tykkere vævssnit kan opsamles. Brug kun IR laser kræver, at LCM cap membran er helt smeltet over hele væv området. Derudover ufuldstændig samling af vævet er typisk og normalt kræver flere forsøg. Selv om dette tager længere tid end at isolere væv fra membranen slide PEN, hvis den tilgængelige væv er allerede på et objektglas eller en UV-laser ikke er tilgængelig, dette er en farbar vej, da de fleste af vævet kan indsamles (figur 8J).
ove_content "> Kritiske trin100% ethanol inkubationer er en af de vigtigste trin. For at indsamle celler fra Silan-prep slides kræves fuldstændig dehydrering af vævet. Derfor vil enhver vand fjernes ikke, som for det meste er forbundet med 100% ethanol inkubation påvirke evnen til at samle op celler fra dias. For at løse dette problem, ofte ændre 100% ethanol løsninger absorption af vand fra luften eller overførsel fra tidligere vasketrin kan påvirke dehydrering. Derudover er molekylsigter anvendes til at absorbere enhver forurening vand. Det LCM bør ideelt være placeret i et lille rum med en affugter til at opretholde betingelser lav luftfugtighed.
Gode cryostatsnit er afgørende for korrekt LCM. Sektioner nødt til at være flad med folder i vævet minimeret. Folder i vævet vil øge afstanden mellem LCM hætte og forhindre det i kontakt than væv. Det bliver derefter vanskeligt at tilstrækkelig smelte membranen hætten på vævet. For objektglas, typisk snittykkelse skal være mellem 6 og 12 um. Tykkere sektioner kan indfanges med pennen membran dias.
LCM tilbyder en teknisk kapacitet til at gøre meget præcise dissektioner af væv og celler fra objektglas. Dette dramatisk øger opløsningen for yderligere analyse i forhold til grov dissektion af væv stykker. Selv LCM kan være tids- og arbejdskrævende, kræver det ikke omfattende uddannelse eller ekspertise og, når kombineret med andre af avanceret teknologi, kan i høj grad øge forståelsen af en biologisk proces, når der anvendes diskrete celler eller anatomiske regioner.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 – 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Numer | Comments |
Veritas Laser Capture Microdissection System | Life Technologies, Grand Island, NY | Newer model is now sold | |
CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0211 | |
CapSure HS LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0213 | |
PEN Membrane slides | Life Technologies, Grand Island, NY | s4651 | |
Silane prep-slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S4651 | |
95% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7148 | |
100% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
Rnase Free Triton | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8787 | |
Molecular Sieve | EDM Millipore, Billerica, MA | MX1583D | |
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody | EDM Millipore, Billerica, MA | Ab152 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies, Grand Island, NY | A-11008 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2939AA | |
Stratagene MX 3005P | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 401513 | |
Nanodrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ||
Quant-iT RiboGreen | Life Technologies, Grand Island, NY | R11490 | |
RNaseZap | Life Technologies, Grand Island, NY | AM9780 |