Rapid Identifikasjon av kjemiske Genetiske interaksjoner i<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
Abstract
Bestemme virknings av bioaktive kjemikalier er av interesse for et bredt spekter av faglige, farmasøytisk og industrielle forskere. Saccharomyces cerevisiae, eller spirende gjær, er en modell eukaryote som en komplett samling av ~ 6000 genet delesjonsmutanter og hypomorphic viktig genet mutanter er kommersielt tilgjengelige. Disse samlinger av mutanter kan bli brukt til å detektere systematisk kjemisk-genet interaksjoner, dvs. gener som er nødvendige for å tåle et kjemikalie. Denne informasjonen, i sin tur, rapporterer om den sannsynlige virkningsmåte av forbindelsen. Her beskriver vi en protokoll for rask identifisering av kjemiske-genetiske interaksjoner i spirende gjær. Vi viser fremgangsmåten ved hjelp av det kjemoterapeutiske middel 5-fluoruracil (5-FU), som har en veldefinert virkningsmekanisme. Våre resultater viser at det kjernefysiske TRAMP exosome RNA og DNA-reparasjonsenzymer er nødvendig for proliferasjon i nærvær av 5-FU, som er i samsvar med tidligere microarray basert strekkoding kjemiske genetiske tilnærminger og vissheten om at 5-FU negativt påvirker både RNA og DNA metabolisme. De nødvendige valideringsprotokoller av disse high-throughput skjermer er også beskrevet.
Introduction
De genetiske verktøy og ressurser tilgjengelig i modellorganisme Saccharomyces cerevisiae har aktivert storskala funksjonell genomikk studier som samlet gir ny innsikt i hvordan gener fungere som nettverk for å oppfylle kravene i biologiske systemer. Hjørnesteinen i disse verktøyene var samarbeids etableringen av et komplett sett av ikke-essensielle gendelesjoner av alle åpne leserammer i gjær 1,2. Et slående observasjon var at bare ~ 20% av gjær gener er nødvendig for levedyktighet når vokst som haploids under standard laboratorieforhold. Dette fremhever muligheten for en celle til buffer mot genomiske forstyrrelser gjennom utnyttelse av alternative biologiske trasé. Genetiske mutanter som er levedyktig individuelt, men dødelig i kombinasjon, signal tilkoblede eller konvergent parallelle biologiske stier og danne genetiske interaksjonsnettverk som beskriver biologisk funksjon. Med utvikling av betinget temperature-sensitive og hypomorphic alleler av essensielle gener teknologien ikke har vært begrenset til studiet av ikke-essensielle gener 3,4. Dette konseptet har blitt brukt på en genomisk skala produsere en upartisk genetisk interaksjon kart som illustrerer hvordan gener involvert i lignende cellulære prosesser klynge sammen fem.
Kjemiske forstyrrelser av genetiske nettverk ligne gendelesjoner (figur 1) 6. Spørring veksthemmende forbindelser mot en høy tetthet rekke sletting stammer for overfølsomhet identifiserer en kjemisk-genetisk interaksjon profil, dvs. en liste av gener som er nødvendig for å tåle kjemisk stress. Som genetiske interaksjoner, har store skjermer av kjemiske biblioteker vist at forbindelser med en lignende virknings klynge sammen syv. Derfor, ved å etablere den kjemiske-genetisk interaksjon profil av en sammensatt modusen for handling, kan utledes ved å sammenligne det med LARge-skala syntetiske genetiske og kjemiske genetisk interaksjon datasett 8,9.
Storskala kjemisk-genetiske skjermer, hvor score av forbindelser er avhørt, har blitt utført av strekkode konkurranse analyser. I denne fremgangsmåten, blir den samlede samling av delesjonsstammer dyrkes en masse i flere generasjoner i et lite volum av medium inneholdende en kjemisk. Siden hver sletting mutant havner en unik genetisk strekkode, er levedyktigheten / vekst av individuelle mutanter i bassenget av slette stammer sporet av microarray eller high-throughput sekvense 10.
Dedusere fitness ved å overvåke koloni størrelse på fysisk oppstilt mutanter dyrket på fast agar inneholder en bioaktive stoffet er også en effektiv metode for å identifisere kjemiske-genetiske interaksjoner 11,12. Denne tilnærmingen gir et kostnadseffektivt alternativ til konkurransebasert screening og er godt egnet for analyse av små bibliotek av kjemikalier.Skissert her er en enkel metode for å produsere en liste over kjemiske-genetiske interaksjoner i S. cerevisiae som ikke er avhengig av molekylærbiologi manipulasjoner eller infrastruktur. Det krever bare en gjær sletting samling, en robot eller manuell låsing apparat, og fritt tilgjengelig programvare for bildeanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skissert her er en tilnærming for å generere kjemiske-genetisk interaksjon profiler. Fremgangsmåten er enkel: ved å sammenligne koloni størrelser av hver stamme i omfattende genet delesjons samlinger i nærvær og fravær av en kjemisk, er alle gener nødvendige for å tolerere en kjemisk skade identifisert. Stempler anrikning analyse av det resulterende listen av følsomme stammer kan deretter brukes til å gi innsikt i en kjemikalier virkningsmåte. Mens denne protokollen har blitt optimalisert for spirende gjær…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i CJN lab er støttet av driftstilskudd fra NSERC, den kanadiske Cancer Society Research Institute (CCSRI), og den kanadiske Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
Referências
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
