Быстрая идентификация химических генетических взаимодействий в<em> Saccharomyces Cerevisiae</em
Summary
Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
Abstract
Определение механизма действия биологически активных химических веществ, представляет интерес для широкого круга ученых, фармацевтической и промышленных учреждений. Saccharomyces Cerevisiae или почкованием дрожжи, является модель эукариот, для которых полная коллекция ~ 6000 делеции гена мутантов и Гипоморфные основного гена мутанты являются коммерчески доступными. Эти сборники мутантов может быть использован для систематического выявления химико-гена взаимодействий, т.е. гены, необходимые, чтобы переносить химического вещества. Эта информация, в свою очередь, сообщает о вероятном механизме действия этого соединения. Здесь мы опишем протокол для быстрой идентификации химико-генетических взаимодействий у почкующихся дрожжей. Показано, метод с использованием химиотерапевтического агента 5-фторурацил (5-FU), который имеет четко определенный механизм действия. Наши результаты показывают, что ядерная TRAMP РНК экзосома и ферментов репарации ДНК необходимы для пролиферации в присутствии 5-ФУ, который согласуется с предыдущими мicroarray штрих-кодированием химические генетические подходы и знания, что 5-FU негативно влияет как на РНК и ДНК обмен веществ. Необходимые протоколы проверки этих экранов с высокой пропускной способностью, также описаны.
Introduction
Генетические инструменты и доступные в модельной организма Saccharomyces Cerevisiae ресурсы позволили масштабные функциональной геномики исследований, которые в совокупности обеспечивают новое понимание того, как гены функционируют как сети для выполнения требований биологических систем. Краеугольным камнем этих инструментов была совместная создание полного набора незаменимых генов удалений всех открытых рамок считывания в дрожжах 1,2. Поразительным наблюдением было то, что только ~ 20% генов дрожжей, необходимые для жизнеспособности при выращивании в гаплоидов в стандартных лабораторных условиях. Это подчеркивает способность клетки к буфера против геномных возмущений за счет использования альтернативных биологических путей. Генетические мутанты, которые являются жизнеспособными индивидуально, но смертельным в сочетании сигнала, подключенных или конвергентные параллельных биологические пути и создавать сети генетического взаимодействия, которые описывают биологическую функцию. С развитием условного Теmperature-чувствительные и гипоморфные аллели важных генов технология не ограничивается изучением несущественных генов 3,4. Эта концепция была применена в геномной шкале производить объективную карту генетического взаимодействия, иллюстрирующий, как гены, участвующие в подобных клеточных процессов кластер вместе 5.
Химические возмущения генных сетей мимические генов делеции (Рисунок 1) 6. Запрос ингибирующее рост соединений против высокой плотности множества штаммов удалений гиперчувствительности идентифицирует профиль химико-генетического взаимодействия, т.е. список генов, которые требуется переносить химическую нагрузку. Как генетических взаимодействий, крупномасштабные экраны химических библиотек, показали, что соединения с аналогичной способ действия кластера вместе 7. Таким образом, путем создания химико-генетический профиль взаимодействие соединения механизм действия, могут быть установлены путем сравнения его с LARGE масштаб синтетический генетических и химических генетического взаимодействия наборы данных 8,9.
Крупномасштабные химико-генетический экраны, где множество соединений, опрошенные, были выполнены конкуренции штрих-код анализов. При таком подходе Объединенные коллекции штаммов с делецией выращивают в массе в течение нескольких поколений в небольшом объеме среды, содержащей химическое вещество. Поскольку каждый мутант с делецией таит в себе уникальную генетическую штрих-код, жизнеспособность / рост отдельных мутантов в бассейне штаммов удаление отслеживается микрочипов или высокой пропускной последовательности 10.
Выведение пригодность мониторинга размеры колоний физически Arrayed мутантов, выращенных на агара, содержащего биологически активного соединения также эффективный метод, чтобы идентифицировать химические-генетических взаимодействий 11,12. Такой подход обеспечивает экономичную альтернативу к конкурсу на основе отбора и хорошо подходит для опробования небольших библиотек химических веществ.Изложенные здесь просто методология составления перечня химико-генетических взаимодействий в S. Cerevisiae, что не зависит от молекулярной биологии манипуляции или инфраструктуры. Она требует лишь сбор дрожжей удаление, робота или вручную фиксации в аппарат, и свободно доступного программного обеспечения для анализа изображений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изложенные здесь подход для создания химико-генетических профилей взаимодействия. Метод прост: путем сравнения размеров колонии каждого из штаммов в полных коллекций делеции гена в присутствии и в отсутствие химической, все гены, необходимые, чтобы переносить химическую инсульт опре…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в лаборатории CJN поддерживается операционными грантов NSERC, Научно-исследовательского института Канады общества рака (CCSRI), и Канадский Фонд рака молочной железы (BC-Юкон филиал).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
Referências
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
