Usando ensaios ex vivo otimizados de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC), mostramos que uma preparação de produto de tabaco combustível suprime acentuadamente as citocinas secretadas intracelularmente mediadas por receptores e a capacidade citolítica de PBMCs efetores. Esses ensaios rápidos podem ser úteis na avaliação do produto e na compreensão dos potenciais efeitos a longo prazo da exposição ao tabaco.
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Artigo de método
Métodos para avaliar a citotoxicidade e Imunossupressão de combustível tabaco Preparações Produto
Neste artigo
Resumo
Resumo
Entre outras alterações fisiopatológicas, a exposição crónica ao fumo do cigarro provoca a inflamação e a supressão imunitária, que têm sido associados ao aumento da susceptibilidade dos fumadores a infecções microbianas e a incidência de tumores. Ex vivo supressão de respostas imunes mediadas por receptores em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) tratadas com constituintes do fumo é uma abordagem atraente para estudar os mecanismos e avaliar os possíveis efeitos a longo prazo da exposição a produtos do tabaco. Aqui, nós optimizado métodos para realizar ensaios ex vivo utilizando PBMC estimuladas por lipopolissacarídeo bacteriano, um receptor-ligando 4 de tipo Toll. Os efeitos do meio condicionado de fumo todo (WS-CM), a preparação de produtos de tabaco combustível (TPP), e nicotina foram investigados sobre a secreção de citocinas e alvo morte celular por PBMC nos ensaios ex vivo. Mostramos que as citocinas secretadas IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, e IL-8 e citocinas intracelulares IFN-47 ;, o TNF-α, e MIP-1α foram suprimidos em PBMC WS-CM-expostos. A função citolítica de PBMC efectoras, conforme determinado por um ensaio de matar células K562 alvo também foi reduzida por exposição a WS-CM; nicotina era minimamente eficaz nestes ensaios. Em resumo, é apresentado um conjunto de ensaios melhorados para avaliar os efeitos de UTEs em ensaios ex vivo, e estes métodos podem ser facilmente adaptados para testar outros produtos de interesse.
Introdução
Um corpo substancial de pontos de conhecimento para os efeitos adversos para a saúde de tabagismo crônico, incluindo a doença cardiovascular (DCV), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e câncer de 1,2. Fumar do cigarro crónica tem sido conhecido por causar inflamação e supressão imune, e estas alterações estão relatados para contribuir para o aumento do risco de infecção microbiana e o cancro em fumadores 3. Estudos in vitro e ex vivo, as técnicas são úteis para elucidar a base molecular dos efeitos patofisiológicos de fumaça de cigarro 4-9 (Tabela 1) e são reconhecidos como importantes ferramen....
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Protocolo
NOTA: consentimento informado por escrito para fazer este estudo foi obtido em uma unidade de pesquisa clínica local, sob aprovação IRB, por Boas Práticas Clínicas. Processamento do sangue, o isolamento de PBMC e as outras experiências de cultura de células são realizadas em condições estéreis, utilizando reagentes e fornecimentos microbiologicamente estéreis.
1. Preparação WS-CM
- Gerar WS-CM como descrito anteriormente 12.
- Prepare WS-CM, passando fumaça de quatro 3R4F cigarros de referência através de Roswell Instituto Memorial Park (RPMI) 1640 sem vermelho de fenol usando o seguinte esquema de fumar: 35-60-....
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Resultados
Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média (quatro amostras do dador). T-teste do aluno entre amostras de controlo tratados e não tratados foi realizada utilizando o software Excel, bem como comparações t-teste para todos os tratamentos com seus controles correspondentes. A significância estatística foi indicada por: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005.
Para medir o efeito da exposição a WS-CM e nicotina, as PBMC foram tratadas com diferentes concentraçõ.......
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Discussão
Nós e outros autores demonstraram previamente que o tratamento das PBMC com UTEs suprime a várias respostas, incluindo a expressão e a secreção de citocinas e medidas funcionais, tais como células alvo de matar 14. Os métodos experimentais descritos na obra anterior exigem períodos de incubação mais longos e eram modestas em magnitude 14. Dadas as potenciais aplicações desse modelo atrativo ex vivo para pesquisa básica e aplicada, investigamos se algum dos parâmetros do ensaio nestes ensai.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho é financiado pela RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) sob um contrato de investigação em colaboração com a Escola Wake Forest University of Medicine. GL Prasad é um funcionário em tempo integral da RJRT.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de 12 x 75 mm | BD Falcon | 352058 | |
| Tubos cônicos de 15 ml | Corning | 430790 | |
| Microtubos de 2 ml Axygen | MCT-150-CS | ||
| 3R4F cigarros de referência | Univ. de Kentucky, Faculdade de Agricultura | 3R4F | |
| Tubos cônicos de 50 ml | Corning | 430828 | |
| frasco | de 500 mlCorning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| placa de fundo plano de 96 poços | Termo Nunc | 439454 | |
| placas de fundo redondo de 96 poços | BD Falcon | 353077 | |
| Capuz de cultura de células | Centrífuga Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Eppendorf | 58110R | ||
| CFSE | Sondas Moleculares Life Technologies | C34554 | |
| Tubos de cluster | Corning | 4401 | Nocivo se ingerido, cancerígeno |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Inflamável |
| DMSO (dimetilsulfóxido) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analisa dados CBA |
| Unidade de filtro | Nalgene | 156-4020 | |
| Citômetro de fluxo | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 cores, em Ex 405 e Em 785. |
| Citômetro de fluxo | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 cores em Ex 495 e Em 785. |
| Software de análise de citometria de fluxo | Tree Star | FlowJo | |
| Recipiente de congelamento | Nalgene | 5100-0001 | Contém DMSO, irritante |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinógeno, irritante, corrosivo |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Kit | de citocinas inflamatórias humanasBD Biosciences | 551811 | |
| IFN-&gama; V-500 Anticorpo | BD Horizon | 561980 | sensibilizador de pele |
| IL-8 ELISA Kit | R e D Sistemas | DY208 | |
| Tampão de isolamento | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Líquido inflamável, irritante |
| Álcool isopropílico | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamina | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α Anticorpo PE | BD Pharmingen | 554730 | Toxicidade aguda, oral |
| Monensina | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotina | Sigma-Aldrich | N3876 | Toxicidade aguda, perigo ambiental |
| Parafilm | Bemis | " M" | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | Inflamável, irritação da pele |
| Caneta/estreptococo | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Buffer de corrida | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-&alfa; Alexa Fluor 488 Anticorpo | BioLegend | 502915 | |
| Pipeta de transferência | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Referências
- How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogu....
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Reimpressões e permissões
