Methoden zur Zytotoxizität und Immunsuppression mit brennbarem Tabakwaren Vorbereitungen Bewerten
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
Unter anderen pathophysiologischen Veränderungen, chronische Exposition gegenüber Zigarettenrauch verursacht Entzündungen und Immununterdrückung, die mit einer erhöhten Anfälligkeit von Rauchern um mikrobielle Infektionen und Tumorhäufigkeit in Verbindung gebracht wurden. Ex-vivo-Unterdrückung der Rezeptor-vermittelten Immunantworten in humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) mit Rauchbestandteile behandelt ist ein attraktiver Ansatz für die Mechanismen untersuchen und bewerten die möglichen langfristigen Auswirkungen der Exposition gegenüber Tabakwaren. Hier optimierten wir Methoden zur Ex-vivo-Tests unter Verwendung von PBMCs durch bakterielles Lipopolysaccharid, ein Toll-like Rezeptor-4-Liganden stimuliert durchzuführen. Die Auswirkungen der ganze Rauch-konditioniertes Medium (WS-CM) wurde eine brennbare Tabakprodukt Zubereitung (TPP) und Nikotin auf die Zytokinsekretion und die Zielzelle Tötung durch PBMCs in den ex-vivo-Tests untersucht. Wir zeigen, dass Zytokine IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 und IL-8 und intrazellulären Cytokinen IFN-47 ;, TNF-α und MIP-1α in WS-CM-belichteten PBMCs drückt. Die cytolytische Funktion von Effektorzellen PBMCs, wie durch einen K562 Targetzelle töten Assay bestimmt wurde ebenfalls durch Einwirkung von WS-cm verringert; Nikotin war minimal wirksam in diesen Assays. Zusammenfassend stellen wir eine Reihe von verbesserten Assays, um die Auswirkungen TPPs in ex-vivo-Untersuchungen zu bewerten und diese Methoden ohne weiteres zur Prüfung andere Produkte von Interesse angepasst werden.
Introduction
Ein wesentlicher Körper des Wissens verweist auf die negativen gesundheitlichen Auswirkungen von chronischen Zigarettenrauchen, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) und Krebs 1,2. Chronischen Rauchens ist bekannt, Entzündung und Immunsuppression verursachen, und diese Veränderungen werden berichtet, um zu einer erhöhten Gefahr der mikrobiellen Infektion und Krebs bei Rauchern 3 beitragen. In-vitro- und ex-vivo-Techniken nützlich sind bei der Aufklärung der molekularen Grundlage der pathophysiologischen Wirkungen Zigarettenrauch 4-9 (Tabelle 1) und werden als wichtige Instrumente zur Führung des Schwellen Regulierung verschiedener Tabakwaren 10,11 anerkannt.
Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass brennbare Tabakprodukt Zubereitungen (TPPs) wie Vollrauch konditioniertes Medium (WS-CM) und die Gesamtpartikelmaterial (TPM) sind weitaus zytotoxische und schädlich fürDNA als nichtbrennbar TPPs oder Nikotin 12,13. In Übereinstimmung mit der veröffentlichten Arbeiten wurde kürzlich berichtet, dass brennbare TPPs oder Nikotin 12,13. In Übereinstimmung mit der veröffentlichten Arbeiten, die wir vor kurzem berichtet, dass brennbare TPPs verursacht deutliche Immunsuppression. Dies wurde durch die Suppression der Toll-like Rezeptor (TLR) -Liganden belegt, stimuliert Zytokinsekretion und Zielzelle (K562) Tötung durch PBMCs in einem ex vivo-Modell 14. Angesichts der Bedeutung der Entzündung im Zigarettenrauch induzierten Krankheitsprozesse wird eine weitere Optimierung der Testbedingungen, die immunmodulatorische Wirkung von Zigarettenrauch zu bewerten in diesem Bericht.
Die ex-vivo-Untersuchungen in der Regel gemessen und intrazelluläre Zytokine sowie die zytolytische Funktion von zytotoxischen T und NK-Zellen in K562-Zellen zu töten Assays 14. Die Assays beteiligt Vorinkubation mit WS-CM und Nikotin und nachfolgende Stimulation von PBMCs mit TLR-Agonisten über einen Zeitraum von 3 Tagen; die endgültige Auslesen durchgeführt werden unter Verwendung von Enzym-Immuntests (ELISAs) und / oder Durchflusszytometrie. Wir verwendeten bakteriellen Lipopolysaccharid (LPS), die TLR-4-Rezeptoren bindet und stimuliert PBMCs, was zur Produktion von intrazellulären Cytokinen und Sekretion von Zytokinen. Zusätzlich zur Optimierung der verschiedenen Assayschritte zum Auswerten der immunmodulatorischen Wirkung von TPPS präsentieren wir auch Verfahren zur Isolierung von PBMCs, Zelltodassays und IL-8 Quantifizierung. Diese Methoden angewendet werden, um andere Forschungsfragen anzugehen und weiter verfeinert, um Tabakwaren in der Regelungszusammenhang zu bewerten.
Tabelle 1 veröffentlichte Berichte über In-vitro- und Ex-vivo-Methoden zur Varilux pathophysiologischen Wirkungen von Tabakprodukt Vorbereitungen studieren CS, Zigarettenrauch Medium. CSC, Zigarettenrauch Kondensat; CSE, Zigarettenrauch-Extrakt; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; GADPH, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase; qPCR, quantitative Polymerase-Kettenreaktion; RT, Echtzeit quantitative Polymerase-Kettenreaktion; TS, Tabakrauch.
| Autor (Studienjahr) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Erden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Verwendeten Zellen | Menschen bronchiale Endothelzellen (BEAS-2B), humanen Neutrophilen | Menschen Alveolarepithelzellen (A549) | Menschlichen glatten Atemwegsmuskulatur (HASMC) | Menschen premonocytic U937-Zellen, menschlichen Monozyten | Alveolaren Typ II Epithelzellen (ATII) | Humanen monozytärenZellinie (THP-1), menschliche Lungenmakrophagen |
| TPP verwendet | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Methode verwendet | ELISA, qPCR, Migration, Elektroschalt | Immunhistochemische Chemie, Elektrophorese Array Kit, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, Elektrophorese | Gel-Mobility-Shift- | Lichtmikroskopie, Elektronenmikroskopie, Elektrophorese, ELISA | qPCR, ELISA, E-toxate Kits (Sigma), p65-Platten-Assay (TransAM), Elektrophorese, verschiedenen Immunoassay-Kits |
| Maßnahme | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-KB, Migration | Histonacetyltransferasen, Histondeacetylasen, NF-kappaB, IL-8, pI & kgr; B-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, Eotaxin | Hitzeschock / Stressproteine (HSP / Hsp70), HF-Transkriptionsfaktor, NF-kB,TNF-α | Surfactant Protein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK-Phosphorylierung cJun: DNA-Bindung, Glutathion, p65: DNA-Bindung |
| Endergebnis | CSE herunterreguliert Zytokin-Produktion durch Unterdrückung der AP-1-Aktivierung. | H 2 O 2 und CSC verbessern Acetylierung von Histon-Proteine, zu verringern Histon-Deacetylase-Aktivität, differenziell reguliert proinflammatorische Zytokin-Freisetzung. | Zigarettenrauch kann die Freisetzung von IL-8 aus HASMC, durch TNF-α, 20% CSE weniger IL-8-Freisetzung, Hemmung der Eotaxin und RANTES erweitert durch Zigarettenrauch verursacht. | TS aktiviert HF Transkriptionsfaktor, der mit Hsp70-Überexpression und Hemmung der NFkB-Bindungsaktivität und TNF-α Freisetzung assoziiert war. | Reduzierte ATII Zellen abgeleiteten Chemokin Ebenen Kompromisse alveolar Reparatur, einen Beitrag zur Zigarettenrauch induzierten Alveolarschaden und Emphysem. | Daten liefern mechanistische Erklärung dafür, warum Raucher haben erhöhte Atmungsinfektionen. Unterdrückung des unspezifischen Reaktion wird durch einen Anstieg der IL-8 begleitet. |
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir und andere haben vorher gezeigt, dass die Behandlung der PBMCs mit TPPs drückt mehreren Antworten, von denen die Expression und Sekretion von Zytokinen und funktionellen Maßnahmen wie Ziel zelltötende 14. Die in der bisherigen Arbeit beschriebenen experimentellen Methoden erfordern längere Inkubationszeiten und waren bescheiden in der Größe 14. Angesichts der potentiellen Anwendungen dieser attraktiven ex vivo Modell für Grundlagen- und angewandten Forschung haben wir untersucht…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) im Rahmen eines Sonderforschungsvereinbarung mit der Wake Forest University School of Medicine finanziert. GL Prasad ist ein Vollzeit-Mitarbeiter von RJRT.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Referências
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