Metoder for å evaluere Cytotoksisitet og Immunsuppresjon av Brenntobakksprodukt Forberedelser
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
Blant andre patofysiologiske endringer, kronisk eksponering for sigarettrøyk fører til betennelse og immunsuppresjon, som har vært knyttet til økt mottakelighet av røykere til mikrobielle infeksjoner og svulstforekomsten. Ex vivo undertrykkelse av reseptor-mediert immunresponser i humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) behandlet med røyk bestanddeler er en attraktiv tilnærming for å studere mekanismer og vurdere sannsynlige langtidseffekter av eksponering for tobakksvarer. Her, vi optimalisert metoder for å utføre ex vivo-tester ved hjelp av PBMC stimulert av bakteriell lipopolysakkarid, en Toll-like receptor-4 ligand. Effektene av hel røyk kondisjonerte medium (WS-CM), ble et brennbart tobakksprodukt forberedelse (TPP), og nikotin undersøkt på cytokinsekresjon og målcellen dreping av PBMC i ex vivo-analyser. Vi viser at utskilte cytokiner IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 og IL-8 og intracellulære cytokiner IFN47 ;, TNF-α, og MIP-1α ble undertrykt i WS-CM-eksponerte PBMC. Den cytolytiske funksjon av effektor PBMC, som bestemt ved en K562 target celledrepende assay ble også redusert ved eksponering for WS-CM; nikotin var minimal effektiv i disse analysene. Som en oppsummering presenterer vi et sett med forbedrede analyser for å evaluere effektene av TPPS i ex vivo-analyser, og disse metoder kan lett tilpasses for testing av andre produkter av interesse.
Introduction
En betydelig mengde kunnskap poeng til negative helseeffekter av kronisk sigarettrøyking, inkludert kardiovaskulær sykdom (CVD), kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) og kreft 1,2. Kronisk sigarettrøyking har vært kjent for å forårsake betennelse og immunsuppresjon, og disse endringene er rapportert å bidra til økt risiko for mikrobiell infeksjon og kreft hos røykere tre. In vitro og ex vivo teknikker er nyttige i å belyse den molekylære grunnlaget for de patofysiologiske effektene av sigarettrøyk 4-9 (tabell 1), og er anerkjent som viktige verktøy for guiding den nye reguleringen av ulike tobakksprodukter 10,11.
For eksempel har vi vist at brenn tobakk produkt preparater (TPPS) som helhet røyk kondisjonerte medium (WS-CM) og partikler (TPM) er langt mer cytotoksiske og skadelig forDNA enn ikke-brennbare TPPS eller nikotin 12,13. Konsistent med det publiserte arbeidet, ble det nylig rapportert at brenn TPPS eller nikotin 12,13. Konsistent med det publiserte arbeidet, vi nylig rapportert at brenn TPPS forårsaket markert immunsuppresjon. Dette ble dokumentert av undertrykkelse av Toll- like receptor (TLR) -ligands, stimulert cytokinsekresjon, og målrettet celle (K562) drept av PBMC i en ex vivo modell 14. Gitt viktigheten av inflammasjon sigarettrøk-induserte sykdomsprosesser, er ytterligere optimalisering av de analysebetingelser for å vurdere immunmodulerende effekter av sigarettrøyk presentert i denne rapport.
Den ex vivo-analyser vanligvis målt intracellulær og utskilt cytokiner, så vel som den cytolytiske funksjon av cytotoksiske T- og NK-celler i K562 celledrepende analysene 14. Analysene involvert pre-inkubering med WS-CM og nikotin og påfølgende stimulering av PBMCs med TLR agonister over en periode på 3 dager; den endelige avlesninger er utført ved hjelp av enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og / eller strømningscytometri. Vi benyttet bakteriell lipopolysakkarid (LPS), som binder til TLR-4-reseptorer og stimulerer PBMC som resulterer i produksjonen av intracellulære cytokiner og utskillelse av cytokiner. I tillegg til optimalisering av de forskjellige analysefremgangsmåten for å vurdere immunmodulerende effekter av TPPS vi dessuten foreliggende fremgangsmåter for isolering av PBMC, celledødsanalyser, og IL-8-kvantifisering. Disse metodene kan brukes til å ta opp andre problemstillinger og videreutviklet for å evaluere tobakksvarer i reguleringssammenheng.
Tabell 1. Publisert rapporter om in vitro og ex vivo metoder som brukes for å studere varilus patofysiologiske effekter av tobakk produkt forberedelser CS, sigarettrøyk medium.; CSC, sigarettrøyk kondensat; CSE, sigarettrøyk pakke; ELISA, enzymbundet immunosorbent assay; GADPH, glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase; qPCR, kvantitativ polymerasekjedereaksjon; RT, sanntid kvantitativ polymerasekjedereaksjon; TS, tobakksrøyk.
| Forfatter (år av studien) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Celler brukes | Menneskelige bronkial endotel celler (BEAS-2B), menneskelige nøytrofile | Menneskelige alveolære epitelceller (A549) | Menneskelige luftveis glatte muskelceller (HASMC) | Menneskelige premonocyttisk U937 celler, humane monocytter | Alveolære type II epitelceller (ATII) | Menneskelig monocyttiskcellelinje (THP-1), humane lungemakrofager |
| TPP brukt | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Metode brukt | ELISA, qPCR, migrasjon, electro skift | Immunohisto-kjemi, elektroforese, Arrayscan kit, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, elektroforese | Gel-mobilitet skift | Lysmikroskopi, elektronmikroskopi, elektroforese, ELISA | qPCR, ELISA, E-toxate kit (Sigma), p65 plate analysen (Transam), elektroforese, ulike immunologiske kits |
| Mål | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, migrering | Histone acetyltransferases, histone deacetylases, NF-kB, IL-8, pI kB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxin | Varme sjokk / stressproteiner (HSP / Hsp70), HF transkripsjonsfaktor, NF-kB,TNF-α | Overflateaktivt protein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK-fosforylering, cJUN: DNA-binding, glutation, p65: DNA-bindende |
| Sluttresultatet | CSE nedregulerer cytokinproduksjon via undertrykkelse av AP-1-aktivering. | H 2 O 2 og CSC forbedre acetylering av histonproteiner, redusere histondeacetylase aktivitet, differensielt regulere proinflammatoriske cytokiner utgivelse. | Sigarettrøyk kan forårsake frigjøring av IL-8 fra HASMC, forsterkes av TNF-α, 20% CSE mindre IL-8-frigjøring, inhibering av eotaksin og RANTES av sigarettrøyk. | TS HF aktivert transkripsjonsfaktor, noe som var forbundet med Hsp70 overekspresjon og hemming av NFkB-bindende aktivitet og TNF-α frigjøring. | Redusert ATII celle-stammer chemokin nivåer kompromiss AlveoLar reparasjon, noe som bidrar til sigarettrøyk-indusert alveolar skade og emfysem. | Data gir mekanistisk forklaring på hvorfor røykere har økt luftveisinfeksjoner. Undertrykkelse av den iboende respons er ledsaget av en økning i IL-8. |
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi og andre har tidligere vist at behandling av PBMC med TPPS undertrykker flere responser, inkludert ekspresjon og sekresjon av cytokiner og funksjonelle tiltak som target celledrepende 14. De eksperimentelle metodene beskrevet i tidligere arbeid krever lengre inkubasjonsperioder og var beskjeden i størrelse 14. Gitt den potensielle anvendelser av denne attraktive ex vivo modell for grunnforskning og anvendt forskning, undersøkte vi om noen av analyseparametere i disse flertrinns biolog…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er finansiert av RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) under et forskningssamarbeid avtale med Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad er en fulltids ansatt i RJRT.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Referências
- . . How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration’s Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
