Métodos para evaluar la citotoxicidad y la inmunosupresión de Combustible Tabaco Preparativos del producto
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
Entre otros cambios fisiopatológicos, la exposición crónica al humo del cigarrillo provoca inflamación y la supresión inmune, que han sido vinculados a un aumento de la susceptibilidad de los fumadores a infecciones microbianas y la incidencia de tumores. Ex vivo supresión de las respuestas inmunes mediadas por el receptor en las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) tratado con los componentes del humo es un enfoque atractivo para estudiar los mecanismos y evaluar los probables efectos a largo plazo de la exposición a los productos de tabaco. Aquí, hemos optimizado los métodos para llevar a cabo ensayos ex vivo utilizando PBMCs estimulados por lipopolisacárido bacteriano, un receptor-4 ligando Toll-like. Los efectos del humo de medio acondicionado conjunto (WS-CM), una preparación de productos de tabaco combustible (TPP), y la nicotina se investigaron sobre la secreción de citoquinas y la destrucción de células diana por PBMCs en los ensayos ex vivo. Se demuestra que las citoquinas secretadas IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 e IL-8 y citoquinas intracelulares IFN47 ;, TNF-α, y MIP-1α fueron suprimidos en PBMCs expuestos-WS-CM. La función citolítica de PBMCs efectoras, tal como se determina mediante un ensayo de célula diana K562 matar se redujo también por la exposición a WS-CM; nicotina era mínimamente eficaz en estos ensayos. En resumen, presentamos un conjunto de ensayos mejorados para evaluar los efectos de los TPP en ensayos ex vivo, y estos métodos podrían adaptarse fácilmente para probar otros productos de interés.
Introduction
Un importante conjunto de puntos de conocimiento a los efectos adversos para la salud del tabaquismo crónico, incluyendo la enfermedad cardiovascular (ECV), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el cáncer de 1,2. Fumar cigarrillos crónica se ha sabido para causar la inflamación y la supresión inmune, y estas alteraciones se informó de contribuir a un mayor riesgo de infección microbiana y el cáncer en fumadores 3. In vitro y técnicas ex vivo son útiles en la elucidación de la base molecular de los efectos fisiopatológicos de el humo del cigarrillo 4-9 (Tabla 1) y se reconocen como importantes herramientas para guiar la regulación emergente de diversos productos del tabaco 10,11.
Por ejemplo, hemos demostrado que materias inflamables de productos de tabaco (TPP), como medio de todo el humo acondicionado (WS-CM) y partículas totales (TPM) son mucho más citotóxica y perjudicial paraADN de los TPP no combustibles o la nicotina 12,13. De acuerdo con el trabajo publicado, se informó recientemente que los TPP combustibles o la nicotina 12,13. De acuerdo con el trabajo publicado, recientemente informó de que los TPP combustibles causados inmunosupresión marcada. Esto se evidenció por la supresión de Toll-like receptor (TLR) -ligands, estimulado la secreción de citoquinas y célula diana (K562) matando por PBMCs en un modelo ex vivo 14. Dada la importancia de la inflamación en los procesos de enfermedad inducida por el humo de cigarrillos, una mayor optimización de las condiciones de ensayo para evaluar los efectos inmunomoduladores del humo del cigarrillo se presenta en este informe.
Los ensayos ex vivo miden típicamente intracelular y citoquinas, así como la función citolítica de las células T citotóxicas y NK en células K562 matar ensayos de 14 secretadas. Los ensayos implicados pre-incubación con WS-CM y la nicotina y la posterior estimulación de PBMCs con TLR agonistas durante un período de 3 días; las lecturas finales se realizaron usando ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y / o citometría de flujo. Hemos utilizado lipopolisacárido bacteriano (LPS), que se une a los receptores TLR-4 y estimula PBMCs que resulta en la producción de citocinas intracelulares y la secreción de citocinas. Además de la optimización de las diferentes etapas del ensayo para evaluar los efectos inmunomoduladores de TPP, nosotros también presentes métodos para el aislamiento de PBMCs, ensayos de muerte celular, y IL-8 cuantificación. Estos métodos pueden ser aplicados para abordar otras cuestiones de investigación y perfeccionar todavía más para evaluar los productos del tabaco en el marco regulatorio.
Tabla 1. publicado informes de métodos in vitro y ex vivo utilizan para estudiar varilus efectos fisiopatológicos de las preparaciones de los productos de tabaco CS, medio humo del cigarrillo.; CSC, cigarrillo condensado de humo; CSE, extracto de humo de cigarrillo; ELISA, enzima-ensayo de inmunoabsorción ligado; GADPH, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa; qPCR, reacción de cadena de polimerasa cuantitativa; RT, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real; TS, humo de tabaco.
| Autor (año de estudio) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Las células utilizadas | Células bronquiales humanas endotelio (BEAS-2B), neutrófilos humanos | Células epiteliales alveolares humanos (A549) | Las células del músculo liso de las vías respiratorias Humanos (HASMC) | Las células humanas U937 premonocítica, monocitos humanos | Alveolares tipo II las células epiteliales (ATII) | Monocítica humanalínea celular (THP-1), macrófagos pulmonares humanos |
| TPP utilizado | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Método utilizado | ELISA, qPCR, migración, cambio electromovilidad | Inmunohistoquímica, electroforesis, kit ArrayScan, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, electroforesis | Gel cambio de la movilidad | Microscopía de luz, microscopía electrónica, electroforesis, ELISA | qPCR, ELISA, kit E-Toxate (Sigma), ensayo de placa de p65 (TransAM), electroforesis, varios kits de inmunoensayo |
| Medida | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migración | Acetiltransferasas histonas, las histonas desacetilasas, NF-kB, IL-8, pI kappa B-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxina | Proteínas de estrés / tensión (HSP / Hsp70), factor de transcripción HF, NF-kB,TNF-α | Proteína surfactante (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / fosforilación de ERK, cJUN: unión a ADN, el glutatión, p65: unión al ADN |
| Resultado final | CSE regula a la baja la producción de citoquinas a través de la supresión de la AP-1 de activación. | H 2 O 2 y CSC mejorar la acetilación de las histonas, disminuir la actividad de la histona deacetilasa, diferencialmente regular la liberación de citoquinas proinflamatorias. | El humo del cigarrillo puede causar la liberación de IL-8 de HASMC, reforzada por TNF-α, 20% CSE menos IL-8 liberación, inhibición de la eotaxina y RANTES por el humo del cigarrillo. | TS factor de transcripción HF, que se asoció con sobreexpresión de Hsp70 y la inhibición de la actividad NFkB y la liberación de TNF-α vinculante activados. | Reducción ATII niveles de quimioquinas derivadas de células compromiso alveoreparación lar, contribuyendo al cigarrillo daños y enfisema alveolar inducida por el humo. | Los datos proporcionan explicación mecanicista de por qué los fumadores han aumentado las infecciones respiratorias. Supresión de la respuesta innata está acompañado por un aumento en IL-8. |
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosotros y otros han demostrado previamente que el tratamiento de las PBMC con TPPs suprime varias respuestas, incluyendo la expresión y secreción de citoquinas y medidas funcionales tales como célula diana matando a 14. Los métodos experimentales descritos en el anterior trabajo requieren períodos de incubación más largos y fueron modestos en magnitud 14. Teniendo en cuenta las posibles aplicaciones de este atractivo modelo ex vivo para la investigación básica y aplicada, se inve…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está financiado por RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) bajo un acuerdo de investigación en colaboración con la Wake Forest University School of Medicina. GL Prasad es un empleado a tiempo completo de RJRT.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Referências
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