Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

X-ray fluorescentie beeldvorming maakt zowel de identiteit en hoeveelheid van elementen in een monster ruimtelijk worden opgelost. Invallende röntgenstraling, van een energie groter gekozen dan het elektron bindingsenergie van het zwaarste onderdeel van belang, overwonnen de bindingsenergie van binnenste electronen naar de kern ^1. Hierdoor ontstaat een 'gat' in het elektron shell. Als hogere energie elektronen vallen in deze gaten worden fluorescente röntgenstraling waarvan de golflengte afhangt van de energie scheiding van deze orbitalen. Aangezien de energie afstand van de orbitalen is kenmerkend voor een bepaald element, de röntgenfluorescentie emissie ook karakteristieke golflengten, afhankelijk van het element. Hierdoor emissie bij een karakteristieke golflengte die de identificatie van de aanwezige elementen toelaat. Kalibratie van de fluorescentie-intensiteit maakt de kwantificering van de aanwezige elementen.

X-ray fluorescentie microscopy (XFM) is in toenemende mate benut, mede door de ontwikkeling van zeer briljante X-ray synchrotron bronnen, zoals die bij Spring-8 in Japan, de Europese Radiation Synchrotron Facility (ESRF) in Frankrijk, en de Advanced Photon Source ( APS) in de US ^2. Deze bronnen bieden zeer hoge intensiteit röntgenstralen. Tegelijkertijd, verbetering röntgenoptiek, zoals zoneplaat technologie, kon de concentratie van deze bundels op submicron spots, zij het ​​wat inefficiënt ^3. Met zeer hoge intensiteit balken, een betrekkelijk kleine hoeveelheid licht kan worden gericht voldoende om de endogene metalen in cellen wekken, produceert signaal dat kan worden gemeten met de huidige detectortechnologie. Aldus bestuderen van de chemische biologie van metalen in de cel een applicatie met name gebruik van veel van de recente ontwikkelingen in deze techniek maakt ^4-10.

Er zijn veel kritische factoren worden beschouwd, terwijl appliggend XFM de elementaire verdeling en kwantificering van gekweekte zoogdiercellen of andere biologische monsters te onderzoeken. Ten eerste moet het monster intact te blijven, zowel structureel als wat betreft de elementaire samenstelling, zodat de meting zinvol zijn. Ten tweede moet het monster worden bewaard andere manier zodat het winterhard tot stralingsschade die kan worden veroorzaakt door een gerichte röntgenbundel. Een manier die een monster kan aan deze beide criteria tegelijk is om snel tot een glasachtig, amorfe ijs ^11,12 worden bevroren. Snel invriezen wordt vaak bereikt door middel van verschillende cryopreservatie technieken zoals invallend bevriezing of hoge druk invriezen ^13-16. Het is algemeen aanvaard dat cryopreservatie bewaart totale cellulaire architectuur en de chemische samenstellingen in biologische monsters dicht natieve toestand mogelijk. Chemische fixatie, anderzijds, vanwege de langzame en selectieve penetratie van fixeermiddelen in cellen en weefsels well als latere wijzigingen in membraanpermeabiliteit, kunnen verschillende cellulaire ionen vooral de diffundeerbare ionen zoals Cl, Ca en K worden uitgeloogd, verloren of verplaatst, dus waardoor het onderzoek van deze elementen suboptimale ^17-19 mogelijk te maken. Ondanks het duidelijke voordeel van cryo-fixatie dan chemische fixatie in het algemeen, voor adherente cellen van zoogdieren in het bijzonder, cryopreservatie heeft verschillende beperkingen ^20-23. De meest voor de hand liggende is dat niet elk onderzoek lab heeft een gemakkelijke toegang tot cryopreservatie instrumenten. De meeste huidige hoge druk diepvriezers of zelfs dompelen vriezers zijn kostbaar en bezit alleen een subset van cryo faciliteiten, ver van waar cellen worden geïncubeerd zijn. Het voordeel van cryopreservatie zou kunnen worden verhandeld voor het nadeel van reizen spanning geplaatst op de cellen. Dus, terwijl cryopreservatie is zeker de meest rigoureuze manier om monsters voor X-stralen fluorescentie analyse te bewaren, het is zeker niet de meest toegankelijk is voor alle onderzoekers onder alle omstandigheden;noch is het essentieel – als de metalen worden strak gebonden aan fixeerbaar macromoleculen en de resolutie waarmee het monster wordt afgebeeld groter is dan de schade aan de ultra-microstructuur die kunnen optreden tijdens het drogen. Indachtig de kanttekeningen ^24, kan chemische fixatie en drogen een geschikte keuze te zijn.

Andere factoren in een succesvolle röntgenfluorescentie imagingexperiment omvatten juiste analyse. X-stralen fluorescentie beeldvorming is fundamenteel X-ray fluorescentie-emissie spectroscopie gecombineerd met raster-scan om ruimtelijke resolutie bieden. De X-ray fluorescentie-emissie spectra verzameld bevatten een combinatie van overlappende emissie pieken, achtergrond, en de elastische en inelastische verstrooiing toppen van de invallende bundel. Software die de de-convolutie van deze bijdragen, en de montage van de uitstoot pieken mogelijk maakt, is een kritische ontwikkeling van dit gebied ^25. Ook de ontwikkeling en commerciële distribution van dunne-film standaarden van bekende samenstelling, gebruikt voor fluorescentie-intensiteit ten opzichte materiaalhoeveelheid calibreren is ook belangrijk geweest.

Dit protocol geeft een beschrijving van de bereiding van hechtende cellen door chemische fixatie en drogen aan de lucht. Een essentiële stap in dit proces is de groei van de cellen op het siliciumnitride ramen, die vaak niet goed hechten, waardoor zacht spoelen op een bepaalde wijze sleutel tot succes.

Protocol

1. Voorbereiding van de instrumenten, Substrates, Cultuur Media en Schotels Behandeling van Siliciumnitride (Si 3 N 4) ramen. Open de capsule enigszins door uitknijpen ene uiteinde met het venster op zodanige wijze dat het raam zelf niet knijpen, terwijl het draaien van de andere kant van de capsule met de andere hand. Check een paar omgekeerde, puntig pincet onder stereomicroscoop om ervoor te zorgen dat er geen lijm, gaten of bochten aan het uiteinde. Anders kunnen d…

Representative Results

Het vermogen van X-stralen fluorescentie beeldvorming om informatie over biologische monsters is afhankelijk van deze monsters wordt bereid zodanig dat ze robuust stralingsschade op de tijdschaal van het experiment, en toch hun chemische en structurele karakteristieken goed behouden. Bij bekijken van de resultaten van een monster dat is bereid zoals hierboven is beschreven en afgebeeld, is het mogelijk dat er variatie in de onderhavige elementen – aangeeft dat fixatie behouden deze aspecten van de cel (figuur 1)…

Discussion

X-stralen fluorescentie beeldvorming is bruikbaar in vele gebieden, met inbegrip van aardwetenschappen, materiaalkunde, en chemische biologie ^26-34. Vooruitgang in synchrotron X-stralen, en de nadruk hebben zeer hoge intensiteit balken geproduceerd. Gerichte röntgenstralen voldoende om de endogene metalen in cellen bestaan ​​nu wekken, produceert signaal dat kan worden gemeten met de huidige silicium drift detector technologie. En bestuderen van de chemische biologie van metalen in de cel een applicatie …

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde