Préparation cellules adhérentes pour fluorescence X-ray Imaging par fixation chimique

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

X-ray imagerie de fluorescence permet à la fois l'identité et la quantité des éléments présents dans un échantillon à spatialement résolue. Rayons X incidents, d'une énergie choisie pour être supérieure à l'énergie de l'élément le plus lourd d'intérêt liaison électronique, surmonter l'énergie de liaison des électrons intérieure-shell pour le noyau ^1. Cela crée un «trou» dans la couche électronique. Comme les électrons de haute énergie tombent dans ces trous, les rayons X fluorescents sont émis, dont la longueur d'onde dépend de l'énergie de séparation de ces orbitales. Étant donné que l'espacement en énergie des orbitales est caractéristique d'un élément donné, la fluorescence de rayons X a également émission longueurs d'onde caractéristiques, dépendantes de l'élément. Ce est cette émission à une longueur d'onde caractéristique qui permet d'identifier les éléments présents. L'étalonnage de l'intensité de fluorescence permet la quantification des éléments présents.

Fluorescence X microscopy (XFM) est devenu de plus en plus utilisé, en partie grâce au développement de sources de rayonnement synchrotron à rayons X très brillants, tels que ceux à Spring-8 au Japon, la Facilité européenne de rayonnement synchrotron (ESRF) en France, et l'Advanced Photon Source ( APS) aux États-Unis ^2. Ces sources fournissent de très haute intensité faisceaux de rayons X. Dans le même temps, des améliorations dans l'optique X-ray, comme la technologie de plaque de la zone, a permis la mise au point de ces faisceaux à taches sous-micron, mais plutôt inefficace ^3. Avec mêmes faisceaux de haute intensité, même relativement petite quantité de lumière qui peut être concentrée est suffisante pour exciter les métaux endogènes dans les cellules, produisant un signal qui peut être mesurée avec la technologie de détection actuellement disponibles. Ainsi, l'étude de la biologie chimique des métaux dans la cellule est une application en particulier qui rend l'utilisation de la plupart des développements récents dans cette technique ^4-10.

Il ya beaucoup de facteurs essentiels à prendre en considération tout appcouché XFM pour enquêter sur la répartition des éléments et la quantification des cellules de mammifères cultivées ou d'autres échantillons biologiques. Tout d'abord, l'échantillon doit être conservé intact, à la fois structurellement et par rapport à sa composition élémentaire, pour que la mesure ait un sens. En second lieu, l'échantillon doit également être conservée en quelque sorte de sorte qu'il est robuste aux dégâts d'irradiation qui peut être provoquée par un faisceau de rayons X focalisé. Une façon qu'un échantillon peut répondre à ces deux critères à la fois à congeler rapidement dans une glace amorphe vitreuse ^11,12. Congélation rapide est souvent réalisée grâce à diverses techniques de cryoconservation telles que le gel de plongée ou à haute pression de congélation ^13-16. Il est généralement admis que la cryoconservation préserve architecture cellulaire globale et des compositions chimiques dans des échantillons biologiques aussi près que possible l'état natif. Fixation chimique, d'autre part, à cause de la pénétration lente et sélective des fixateurs dans des cellules et des tissus en well modifications ultérieures de perméabilité de la membrane, peuvent permettre divers ions cellulaires en particulier les ions diffusibles tels que Cl, Ca et K pour être lessivés, perdus ou déplacés, ce qui rend l'enquête de ces éléments sous-optimaux ^17-19. Malgré l'avantage évident de cryo-fixation sur la fixation chimique en général, pour les cellules mammifères adhérentes en particulier, la cryoconservation a diverses limitations ^20-23. La plus évidente est que chaque laboratoire de recherche offre un accès facile aux instruments de cryoconservation. La plupart des congélateurs à haute pression ou même des courants plongent les congélateurs sont coûteux et détenue uniquement par un sous-ensemble d'installations cryogéniques, qui peut être loin de l'endroit où les cellules sont incubées. L'avantage de la cryoconservation pourrait être échangé contre l'inconvénient de stress Voyage placé sur les cellules. Ainsi, alors que la cryoconservation est certainement la façon la plus rigoureuse pour préserver des échantillons pour l'analyse par fluorescence de rayons X, il ne est certainement pas le plus accessible à tous les chercheurs dans toutes les circonstances;il ne est pas toujours indispensable – si les métaux d'intérêt sont étroitement liés à des macromolécules corrigeables, et la résolution à laquelle l'échantillon sera imagée est plus grande que les dommages à l'ultra-microstructure qui pourrait se produire au cours du séchage. Consciente des réserves ^24, fixation chimique et le séchage peuvent être un choix approprié.

D'autres facteurs dans un X-ray expérience d'imagerie de fluorescence succès comprennent une analyse appropriée. X-ray imagerie de fluorescence est fondamentalement X-ray spectroscopie d'émission de fluorescence combinée avec raster-numérisation pour fournir une résolution spatiale. Les spectres émission de fluorescence à rayons X recueillies contiennent une combinaison de chevauchement des pics d'émission, de fond, et les pics de diffusion élastique et inélastique du faisceau incident. Logiciel qui permet la dé-convolution de ces contributions, et le montage des pics d'émission, est un développement important de ce domaine ^25. En outre, le développement commercial et distribution normes de couches minces de composition connue, utilisée pour étalonner l'intensité de fluorescence par rapport à la quantité matière, est également très importante.

Ce protocole fournit une description de la préparation de cellules adhérentes par fixation chimique et séchage à l'air. Une étape cruciale dans ce processus est la croissance des cellules sur les fenêtres de nitrure de silicium, qui souvent ne adhèrent pas bien, ce qui rend le rinçage doux dans une clé de manière particulière à la réussite.

Protocol

1. Préparation des instruments, des substrats, Culture Media et Plats Manipulation de nitrure de silicium (Si 3 N 4) fenêtres. Ouvrir la capsule légèrement en serrant une extrémité portant la fenêtre de manière à ne pas serrer la fenêtre elle-même, tout en faisant tourner l'autre extrémité de la capsule avec l'autre main. Vérifiez une paire de revers, pinces à pointe fine sous stéréomicroscope pour se assurer qu'il n'y a pas de colle, d…

Representative Results

La capacité de l'imagerie par fluorescence des rayons X pour fournir des informations sur les échantillons biologiques est subordonnée à ces échantillons préparés d'une manière telle qu'ils résistent à dégâts d'irradiation sur l'échelle de temps de l'expérience, et encore leurs caractéristiques chimiques et structurelles sont bien préservé. Dans l'affichage le résultat d'un échantillon qui a été préparé comme décrit ci-dessus et imagé, il est possible de voir qu&#…

Discussion

X-ray imagerie de fluorescence est utile dans de nombreux domaines, y compris les sciences de la terre, la science des matériaux et la biologie chimique ^26-34. Les progrès dans les rayons X synchrotron, et leur mise au point, ont produit de très faisceaux de haute intensité. Focused X-faisceaux de rayons suffisante pour exciter les métaux endogènes dans les cellules exister maintenant, de production de signal qui peut être mesurée avec la technologie actuelle silicium détecteur de dérive. Et l'?…

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde