Preparazione cellule aderenti per X-ray Fluorescence Imaging da Chemical Fixation

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

X-ray fluorescenza consente sia l'identità e la quantità di elementi presenti in un campione da spazialmente risolto. Incidente raggi X, di una energia selezionata per essere maggiore dell'energia dell'elemento più pesante di interesse vincolante elettroni, superare l'energia di legame degli elettroni interno-shell al nucleo ^1. Questo crea un 'buco' nel guscio di elettroni. Come elettroni ad alta energia cadono in questi fori, raggi X fluorescenti sono emessi cui lunghezza d'onda dipende dalla separazione dell'energia di tali orbitali. Poiché la spaziatura energia degli orbitali è caratteristica di un dato elemento, l'emissione di fluorescenza a raggi X ha anche lunghezze d'onda caratteristiche, dipendenti sull'elemento. È questa emissione alla lunghezza d'onda caratteristica che permette l'identificazione degli elementi presenti. Calibrazione dell'intensità di fluorescenza permette quantificazione degli elementi presenti.

Fluorescenza a raggi X microscopy (XFM) è diventato sempre più utilizzato, in parte a causa dello sviluppo di fonti di sincrotrone a raggi X molto brillanti, come quelle in Primavera-8 in Giappone, l'europeo di radiazione di sincrotrone (ESRF) in Francia, e l'Advanced Photon Source ( APS) negli Stati Uniti ^2. Queste fonti forniscono altissima intensità fasci di raggi X. Allo stesso tempo, il miglioramento ottica a raggi X, come la tecnologia zone plate, permesso la messa a fuoco di questi fasci a macchie sub-micron, anche se piuttosto inefficiente ^3. Con molto fasci ad alta intensità, anche una quantità relativamente piccola di luce che può essere messo a fuoco è sufficiente per eccitare i metalli endogeni nelle cellule, producendo segnale che può essere misurata con la tecnologia attualmente disponibile rivelatore. Pertanto, lo studio della biologia chimica di metalli nella cella è un'applicazione in particolare, che fa uso di molti dei recenti sviluppi in questa tecnica ^4-10.

Ci sono molti fattori critici da considerare durante la appmentire XFM per indagare la distribuzione elementare e la quantificazione di cellule di mammifero in coltura o altri campioni biologici. In primo luogo, il campione deve essere mantenuto integro, sia strutturalmente e rispetto alla sua composizione elementare, affinché la misura sia significativo. In secondo luogo, il campione deve essere conservato in qualche modo in modo che sia resistente al danno di radiazione che può essere causato da un fascio di raggi X focalizzato. Un modo che un campione può soddisfare entrambi i criteri contemporaneamente deve essere rapidamente congelati in un vetrosa, ghiaccio amorfo ^11,12. Congelamento rapido è spesso raggiunto attraverso varie tecniche di crioconservazione, come tuffo il congelamento o alta pressione congelamento ^13-16. E 'generalmente accettato che la crioconservazione conserva architettura cellulare complessiva e composizioni chimiche in campioni biologici il più vicino possibile allo stato nativo. Fissaggio chimico, d'altra parte, a causa della penetrazione lenta e selettiva di fissativi in ​​cellule e tessuti come well le successive variazioni di permeabilità della membrana, possono consentire vari ioni cellulari soprattutto gli ioni diffusibili come Cl, Ca e K per essere colati, perse o ricollocate, rendendo così investigazione di questi elementi non ottimali ^17-19. Nonostante il chiaro vantaggio di crio-over fissaggio fissaggio chimica in generale, per le cellule di mammifero aderenti in particolare, crioconservazione ha varie limitazioni ^20-23. La più ovvia è che non tutti i laboratori di ricerca ha un facile accesso agli strumenti di crioconservazione. La maggior parte dei congelatori alta pressione correnti o anche immergono congelatori sono costosi e di proprietà solo da un sottoinsieme di strutture cryo, che può essere lontano da dove vengono incubate cellule. Il vantaggio di crioconservazione potrebbe essere scambiato per lo svantaggio di stress viaggi collocato sulle cellule. Così, mentre crioconservazione è sicuramente il modo più rigoroso per conservare campioni per analisi a raggi X di fluorescenza, non è certamente la più accessibile a tutti i ricercatori in tutte le circostanze;né è sempre essenziale – se i metalli di interesse sono strettamente legati alle macromolecole fissabili, e la risoluzione con cui viene ripreso il campione è superiore al danneggiamento del ultra-microstruttura che potrebbero verificarsi durante l'essiccazione. Memore dei caveat ^24, fissaggio chimico e asciugatura può essere una scelta adatta.

Altri fattori in un esperimento di imaging di fluorescenza a raggi X di successo includono l'analisi corretta. X-ray imaging di fluorescenza è fondamentalmente spettroscopia di emissione di fluorescenza di raggi X in combinazione con raster-scanning per fornire la risoluzione spaziale. Gli spettri di emissione di fluorescenza a raggi X raccolti contengono una combinazione di sovrapposizione picchi di emissione, di fondo, e le cime di scattering elastico e anelastico del fascio incidente. Software che consente la de-convoluzione di questi contributi, e il montaggio dei picchi di emissione, è stato uno sviluppo critico per questo campo ^25. Inoltre, lo sviluppo e dist commercialeribution di norme a film sottile di composizione nota, usata per calibrare intensità della fluorescenza rispetto alla quantità di materiale, è stato molto importante anche.

Questo protocollo fornisce una descrizione della preparazione di cellule aderenti da fissazione chimica ed essiccamento all'aria. Un passo fondamentale in questo processo è la crescita delle cellule alle finestre di nitruro di silicio, che spesso non aderiscono bene, rendendo dolce risciacquo in una particolare chiave di modo di successo.

Protocol

1. Preparazione di strumenti, Substrati, Culture Media e Piatti Gestione delle finestre nitruro di silicio (Si 3 N 4). Aprire la capsula leggermente spremitura un'estremità contenente la finestra in modo tale da non comprimere finestra stessa, ruotando l'altra estremità della capsula con l'altra mano. Controllare un paio di inversione, pinzette dalla punta sottile sotto stereomicroscopio per assicurarsi che non ci siano adesivi, lacune o curve sulla punta…

Representative Results

La capacità dell'imaging fluorescenza a raggi X per fornire informazioni sui campioni biologici è subordinato questi campioni essere preparati in modo tale che essi sono robusti alle radiazioni sulla scala temporale dell'esperimento, e tuttavia la loro caratteristiche chimiche e strutturali sono ben conservato. Nella visualizzazione del risultato di un campione che è stato preparato come sopra descritto e illustrato, è possibile vedere che c'è variazione degli elementi presenti – indica che la fissazion…

Discussion

X-ray imaging di fluorescenza è utile in molti campi, tra cui geoscienze, scienza dei materiali e biologia chimica ^26-34. Advances in raggi X di sincrotrone, e la loro messa a fuoco, hanno prodotto molto fasci ad alta intensità. Focused X-ray travi sufficiente per eccitare i metalli endogeni nelle cellule ora esistono, segnale che può essere misurata con la tecnologia attualmente disponibile rivelatore al silicio deriva produzione. E studio della biologia chimica di metalli nella cella è un'applicazio…

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde