化学固定することによりX線蛍光イメージングのための接着細胞の準備

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

X線蛍光イメージングは​​、空間的に分解されるサンプル中に存在する元素の同一性および量の両方を可能にする。 、関心の重い元素の電子の結合エネルギーよりも大きいこと核¹内殻電子の結合エネルギーを克服するために選択されたエネルギーの入射X線、。これは電子殻の「穴」を作成します。高エネルギー電子は、これらの孔に落下するように、蛍光X線は波長がそれらの軌道のエネルギー間隔に依存して放出される。軌道のエネルギー間隔は、与えられた要素の特性であるので、X線蛍光放射は、要素に依存する特徴的な波長を有する。これは、存在する元素の同定を可能にする特性波長におけるこの放出である。蛍光強度の較正要素の定量が存在することができます。

X線蛍光microscopY（XFM）は、フランスの日本におけるSPring-8のもの、欧州の放射線シンクロトロン施設（ESRF）のように、部分的に非常に鮮やかなX線シンクロトロン源の開発に、ますます利用になり、光量子ソース（い米国²でAPS）。これらのソースは、非常に高強度のX線ビームを提供する。同時に、このようなゾーンプレート技術としてX線光学系の改善は、かなり非効率的ではあるが^3、サブミクロンのスポットにこれらのビームの集束を可能にした。非常に高強度のビームを、焦点を合わせることができる光の比較的少量が、現在利用可能な検出器技術を用いて測定することができる信号を生成する、細胞中の内因性金属を励起するのに十分である。このように、セル内の金属の化学生物学を研究することは、この技術の^4-10における最近の進展の多くを利用し、特に1のアプリケーションです。

アプリながら検討すべき多くの重要な要因があります培養哺乳動物細胞または他の生物学的サンプルの元素分布と定量化を調査するXFMに横たわっ。まず、サンプルは有意義であると測定するために、構造的にも、その元素組成については、そのまま保持される必要がある。それは、集束X線ビームによって引き起こされる可能性が放射線損傷に丈夫であるように第二のサンプルはまた、いくつかの方法で保存されなければならない。サンプルを一度にこれらの基準の両方を満たすことができる一つの方法は、急速にガラス質、アモルファス氷^11,12に凍結されるべきである。急速凍結は、多くの場合、プランジ凍結または^13-16の凍結高圧のような種々の凍結保存技術を介して達成される。これは、一般的に凍結保存が可能な限り天然の状態に近い生体試料中の全体的な細胞構造や化学組成を保持することが認められている。 Wなどの細胞や組織への固定剤のゆっくりと選択的な浸透に起因する一方、化学的固定、膜透過性のその後の変化などのエル、従って^17-19次善のこれらの要素の調査をレンダリングする、紛失したり、再配置、例えば、Cl、CaおよびKとして特に拡散イオンを浸出させるための種々の細胞のイオンを可能にすることができる。特に接着性の哺乳動物細胞のための一般的な化学固定、オーバークライオ固定の明らかな利点にもかかわらず、凍結保存は、様々な制限^20-23を持っています。最も明らかな1ではなく、すべての研究室は、凍結保存機器に簡単にアクセスを持っていることである。現在のほとんどの高圧冷凍庫、あるいは冷凍庫を急落は、高価なだけ遠くに細胞が培養される場所からのものであってもよいクライオ施設のサブセットによって所有されている。凍結保存の利点は、細胞上に置か走行ストレスの欠点のために取引されている可能性があります。凍結保存は確実に蛍光X線分析用のサンプルを保存するための最も厳格な方法ですがこのように、それは確かに、すべての状況下で、すべての研究者に最もアクセスすることはできません。またそれは常に重要である – 興味のある金属がしっかりと固定可能な巨大分子に結合して、サンプルが画像化される解像度は、乾燥時に発生する可能性がある超微細構造へのダメージよりも大きいしている場合。警告²⁴留意、化学固定、乾燥は、適切な選択である。

成功したX線蛍光イメージング実験における他の要因は、適切な分析を含む。 X線蛍光画像化は、基本的に空間分解能を提供するために、ラスタースキャンと組み合わせたX線蛍光発光分光法である。収集されたX線蛍光発光スペクトルは、発光ピーク、背景、及び入射ビームの弾性および非弾性散乱ピークの重複の組み合わせを含む。これらの貢献のデコンボリューション、及び発光ピークのフィッティングを可能にするソフトウェアは、このフィールド²⁵に重大な開発であった。また、開発および商業DIST物質量に対する蛍光強度を相対的に較正するために使用される既知の組成の薄膜規格ributionも非常に重要であった。

このプロトコルは、化学固定し、空気乾燥による接着細胞の準備について説明します。このプロセスにおける重要なステップは、多くの場合、成功への特定のファッションのキーに優しいリンスを作り、うまく接着しないシリコン窒化窓に細胞の成長である。

Protocol

楽器、基質、文化メディアと皿の調製窒化ケイ素（のSi 3 N 4）は、Windowsの取扱い。 もう一方の手でカプセルのもう一方の端を回転させながら、少しウィンドウ自体を圧迫しないような方法でウィンドウを含む一方の端を絞ることによってカプセルを開きます。 逆のペアを確認して、実体顕微鏡下での先の細いピンセットは先端の接着剤、隙間や曲がりが?…

Representative Results

生物学的サンプルについての情報を提供するために、X線蛍光イメージングの能力は、これらのサンプルは、それらが実験の時間スケールでの放射線障害に対してロバストであるように準備され次第であり、しかもそれらの化学的および構造的特徴は周知である保存。固定は、細胞のこれらの側面に（ 図1）に保存されていることを示す-上述のように調製し、撮像されたサンプル?…

Discussion

X線蛍光イメージングは、地球科学、材料科学、化学、生物学^26-34を含む多くの分野において有用である。シンクロトロンX線の進歩、およびそれらの焦点は、非常に高強度のビームを生成した。フォーカスX線は、現在利用可能なシリコンドリフト検出器技術を用いて測定可能な信号を生成する、現在存在する細胞における内因性金属を励起するのに十分なビーム。そして細胞中の金?…

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde