Preparando células aderentes para fluorescência de raios-X Imagem por Chemical Fixation

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

De raios-X de imagens por fluorescência permite tanto a identidade e quantidade de elementos presentes numa amostra a ser espacialmente resolvido. Incidentes raios-X, de uma energia seleccionada para ser maior do que a energia do elemento mais pesado de interesse de ligação de electrões, ultrapassar a energia de ligação dos electrões de concha interior do núcleo ^1. Isso cria um "buraco" na camada de elétrons. Tal como electrões de alta energia cair para estes orifícios, raios-X fluorescentes são emitidos cujo comprimento de onda é dependente da energia de separação dessas orbitais. Uma vez que o espaçamento entre a energia das orbitais é característica de um dado elemento, a emissão de fluorescência de raios-X também tem comprimentos de onda característicos, dependentes do elemento. É esta emissão a um comprimento de onda característico que permite a identificação dos elementos presentes. A calibração da intensidade de fluorescência permite a quantificação dos elementos presentes.

Fluorescência de raios X microscopy (XFM) tornou-se cada vez mais utilizada, em parte devido ao desenvolvimento de fontes de síncrotron de raios-X muito brilhantes, como as que estão em Spring-8 no Japão, o Mecanismo Europeu de Radiação Síncrotron (ESRF) em França, eo Advanced Photon Source ( APS) em os EUA ^2. Estas fontes fornecem muito elevado de intensidade de raios-X. Ao mesmo tempo, as melhorias na óptica de raios-X, tal como a tecnologia de placa de zona, permitiu a focagem de feixes para estes pontos de sub-micron, embora bastante ineficiente ^3. Com muito feixes de alta intensidade, mesmo uma quantidade relativamente pequena de luz que pode ser focado é suficiente para excitar os metais endógenos nas células, produzindo sinal que pode ser medido com a tecnologia atualmente disponível detector. Assim, o estudo da biologia química de metais na célula é uma aplicação em particular, que faz uso de muitos dos desenvolvimentos recentes nesta técnica ^4-10.

Há muitos fatores críticos a serem considerados ao appdeitada XFM para investigar a distribuição elementar e quantificação de células de mamíferos em cultura ou outras amostras biológicas. Em primeiro lugar, a amostra tem de ser mantidas intactas, quer estruturalmente quer no que diz respeito à sua composição elementar, em ordem para a medição de ser significativa. Em segundo lugar, a amostra deve ser também preservada de alguma forma de modo que seja resistente aos danos que a radiação pode ser causada por um feixe de raios-X concentrado. Uma maneira que uma amostra pode atender a esses critérios ao mesmo tempo, deve ser rapidamente congelados em um vítreo, gelo amorfo ^11,12. Congelação rápida é muitas vezes conseguida através de várias técnicas de criopreservação, como o congelamento de mergulho ou de alta pressão congelamento ^13-16. É geralmente aceite que a criopreservação preserva arquitectura celular em geral e composições químicas em amostras biológicas quanto à proximidade estado nativo quanto possível. Fixação química, por outro lado, devido à penetração lenta e selectiva de fixadores em células e tecidos como well alterações posteriores como na permeabilidade da membrana, pode permitir que vários íons celulares especialmente os íons difusíveis, como Cl, Ca e K a ser lixiviados, perdidos ou realocados, tornando assim investigação destes elementos sub�timas ^17-19. Apesar da clara vantagem de crio-fixação sobre fixação química em geral, para células de mamíferos aderentes, em particular, a criopreservação tem várias limitações ^20-23. A mais óbvia é que nem todo laboratório de pesquisa tem fácil acesso a instrumentos de criopreservação. A maioria dos congeladores alta pressão actuais nem mergulhar congeladores são dispendiosos e de propriedade apenas de um subconjunto de instalações de crio, que pode ser medida a partir de onde as células são incubadas. O benefício de criopreservação pode ser trocado por a desvantagem de estresse viagens colocado sobre as células. Assim, enquanto a criopreservação é certamente a forma mais rigorosa para preservar amostras para análise de fluorescência de raios-X, não é certamente o mais acessível a todos os investigadores em todas as circunstâncias;nem sempre é essencial – se os metais de interesse estão fortemente ligados a macromoléculas fixável, e a resolução na qual a amostra vai ser trabalhada é maior do que o dano para o ultra-microestrutura que pode ocorrer durante a secagem. Ciente das ressalvas ^24, fixação química e secagem pode ser uma escolha adequada.

Outros fatores em um raio-X experimento imagens de fluorescência de sucesso incluir uma análise adequada. Fluorescência de raios X de imagem é, fundamentalmente, de raios-X espectroscopia de emissão de fluorescência combinado com raster-digitalização para fornecer resolução espacial. Os espectros de emissão de fluorescência de raios-X recolhidos conter uma combinação de sobreposição de picos de emissão de fundo, e os picos de espalhamento de elásticos e inelásticos do feixe incidente. Software que permite que o de-convolution dessas contribuições e na concepção dos picos de emissão, tem sido um desenvolvimento crítico a esse campo ^25. Além disso, o desenvolvimento comercial e distribution de padrões de película fina de composição conhecida e utilizada para calibrar a intensidade da fluorescência em relação à quantidade de material, também tem sido muito importante.

Este protocolo fornece uma descrição da preparação de células aderentes por fixação química e secagem ao ar. Um passo fundamental neste processo é o crescimento das células nas janelas de nitreto de silício, que muitas vezes não aderem bem, fazendo lavagem suave em uma chave de moda especial para o sucesso.

Protocol

1. Preparação de instrumentos, substratos, Meios de Cultura e pratos Manuseio de nitreto de silício (Si 3 N 4) janelas. Abrir a cápsula, apertando ligeiramente uma extremidade que contém a janela de tal modo que não espremer a própria janela, enquanto se rodam a outra extremidade da cápsula com a outra mão. Confira um par de reverso, uma pinça de ponta fina, sob lupa para se certificar de que não há adesivas, lacunas ou curvas na ponta. Caso contrário, as …

Representative Results

A capacidade de imagiologia por fluorescência de raios-X para fornecer informações sobre amostras biológicas depende destas amostras a ser preparada de tal maneira que eles são robustos para os danos da radiação na escala temporal da experiência, e mesmo assim a sua características químicas e estruturais são bem preservada. Ao observar o resultado de uma amostra que tenha sido preparado tal como descrito acima e fotografada, é possível ver que existe uma variação nos elementos presentes – indicando que a …

Discussion

Fluorescência de raios X de imagem é útil em muitos campos, incluindo geociências, ciência dos materiais e biologia química ^26-34. Avanços no síncrotron de raios-X, e sua focalização, têm produzido muito feixes de alta intensidade. Raio-X Focused vigas suficiente para excitar os metais endógenos em células já existentes, produzindo sinal que pode ser medido com a tecnologia atualmente disponível silício detector drift. E estudar a biologia química de metais na célula é uma aplicação em pa…

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde