Vurdering af dendritiske arborization i gyrus dentatus i hippocampus-regionen i mus

Summary

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Abstract

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

Introduction

Dynamiske ændringer i antallet og sammensætningen af synapser er kendetegnende for udvikling, aldring, og mange neurodegenerative sygdomme ^1-3. Evnen af ​​neuroner til at modtage og integrere synaptisk information afhænger dendritisk morfologi og dynamiske ændringer i synaptiske forbindelser. Faktisk findes der en positiv korrelation mellem dendritiske rygsøjlen og synapse nummer, som både påvirker kognitive funktion ^4. Således er det ikke overraskende, at formindskelser i dendritisk rygsøjlen nummer er blevet forbundet med kognitiv dysfunktion i en række neurologiske lidelser ^5-7, hvilket fik stor interesse i dendritiske rygsøjlen kvantificering. Ikke desto mindre er en kvantificering af rygsøjlen tæthed fortsat en tidskrævende og kedelig opgave, der undlader at generere nyttige oplysninger om topografien og distribution af synapser på tværs af dendritiske træ. Heldigvis farvningsmetoder (f.eks Golgi-Cox og doublecortin (DCX)), sammenholdtmed avancerede billeddiagnostiske teknikker kan anvendes til at overvinde de nuværende hindringer og producere billeder af dendritiske arborization høj opløsning på en pålidelig og hurtig måde. Mens Golgi-Cox farvning metode kan anvendes til at vurdere tilstanden af dendritiske arborization i alle neuroner ^8, kan DCX sættes ind til at mærke nyfødte neuroner især i den tandede gyrus og subventrikulære zone ^9, en vigtig overvejelse, da neurogenese forekommer både disse regioner i hele levetiden ^10,11.

Efter farvning blev to billeddannende metoder anvendes til at vurdere dendritiske egenskaber: i) real-time imaging (RTI) og ii) forlænget dybdeskarphed imaging (EDFI). RTI teknik giver et middel til at spore og kvantificere længde og rækkefølge af arborization langs de enkelte dendritiske segmenter og grene. Således gør det muligt at estimere det samlede areal og volumen, der optages af hver dendritisk træ. Flepecifically i RTI metoden brugeren kontinuerligt identificerer segmenterne og genfokuserer iterativt som neuron sporing software indsamler x, y og z-koordinaterne for den dendritiske struktur og rekonstruerer bane af dendritiske struktur i 3D. Forholdsvis, det EDFI metode giver en ret simpel og hurtige midler til vurdering af dendritiske tæthed i temmelig tykke vævsprøver ved at generere et sammensat billede, der giver information om hele z-aksen. For at gøre dette, at brugeren registrerer high definition video filer i hele tykkelsen af ​​sektionen, og derefter bruger software til at søge i videobilleder til at identificere punkter, hvor en pixel er helt i fokus. Efterfølgende fokuserede pixels sammen og integreret i en høj opløsning, sammensat 2D-billede. Dette sammensatte billede indeholder alle pixels, der var i fokus, uanset deres position i z-aksen. Kvalitativ og kvantitativ analyse af disse 2D-billeder kan derefter anvendes til at bestemme densitetenaf dendritiske forgrening i hvert felt.

Endelig præsenterer vi en panoramisk metode til at generere billeder af meget til analyse og vurdering af dendritter i en hel region af interesse høj opløsning. Denne teknik kan anvendes til at afhjælpe manglen på adgang til meget høj opløsning og dyre digitale kameraer. Ved hjælp af denne metode, man fanger serielle billeder på forskellige steder langs x- og y-akserne og derefter automatisk syr dem sammen ved hjælp af et freeware (f.eks Billede Composite Editor). Især kan denne fremgangsmåde anvendes til kvalitativ og kvantitativ vurdering af dendritiske arborization i en temmelig bredt område.

Protocol

BEMÆRK: Forsøg blev gennemført i overensstemmelse med de etiske normer, der er godkendt af Udvalget for Dyrs Forskning ved Veterans Affairs Palo Alto sundhedssystem. 1. Golgi-Cox Farvning Brain udvinding og farvning På 1. dagen, dybt bedøver mus med 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin før euthanizing via afblødning. Fjern forsigtigt calvarium og dissekere ud hjernen. Først fjerne huden på toppen af ​​kraniet, placerer en krum saks på…

Representative Results

Omfanget af arborization skyldes bevarede og nyfødte gyrus granula celler blev analyseret i vildtypemus ved anvendelse af enten Golgi-Cox eller DCX-farvning (figur 1). Dendritiske segmenter af DCX-positive celler blev fundet at være 13-36 mikrometer lange. Den normale fordeling af dendritiske længde blev testet under anvendelse Kolmogorov-Smirnov-test (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; figur 4 og 5). I analysen af ​​læng…

Discussion

Her blev to metoder beskrevet at kvantificere omfanget af dendritiske arborization i modne og nyfødte neuroner ved anvendelse af traditionelle farvningsmetoder sammen med RTI og EDFI. Erhvervelse af billeder af neuroner høj opløsning giver en meget nyttig metode til at teste de skadelige virkninger af neurodegenerative lidelser og til gengæld giver mulighed for at vurdere terapeutiske strategier, der er målrettet hippocampale neuroner.

Mens RTI metode blev anvendt til at fange dybdegåe…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified Golgi-cox staining solution	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x)	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
30% Sucrose,	Sigma	CAS # 57-50-1	make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xylene	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medium	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) white	Electron Microscopy Sciences	71869-10	NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	CAS Number 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	CAS Number 77-86-1	NA
ABC Lite	Vector	PK4000	NA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Digital Camera	Nikon	DS-Ri1
12 bit Camera	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System	MBF Bioscience	V.10
Image Composite Editor	Microsoft	1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00