JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Biologia

En Multi-påvisningsassay for Malaria Fremsendende Myg

Published: February 28, 2015
doi:
10.3791/52385
, , , ,
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology,School of Veterinary Medicine, University of California – Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory,School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Abstract

Den Malariamyg arter komplekse omfatter den største malaria transmission myg i Afrika. Fordi disse arter er af en sådan medicinsk betydning, er flere træk typisk karakteriseret ved hjælp af molekylære assays til støtte i epidemiologiske undersøgelser. Disse træk indbefatter artsidentifikation, insekticidresistens, parasitinfektion status og præference vært. Da populationer af Malariamyg komplekset er morfologisk uskelnelige er en polymerasekædereaktion (PCR), der traditionelt anvendes til at identificere arter. Når arten vides er flere efterfølgende analyser udføres rutinemæssigt for at belyse yderligere egenskaber. For eksempel mutationer kendt som KDR i en para-genet giver resistens mod DDT og pyrethroidinsekticider. Derudover er enzym-linked immunosorbent assays (ELISA'er) eller parasitten Plasmodium DNA-detektion PCR-assays anvendes til at påvise parasitter stede i myg væv. Endelig en combination af PCR og restriktionsenzymsteder fordøjer kan anvendes til at belyse vært præference (f.eks humant vs. dyreblod) ved screening af myg blodmel for vært-specifik DNA. Vi har udviklet en multi-detektion assay (MDA), der kombinerer alle de ovennævnte assays i en enkelt multiplex reaktion genotype 33SNPs til 96 eller 384 prøver ad gangen. Fordi MDA indeholder flere markører for arter, Plasmodium afsløring og vært blod identifikation, er sandsynligheden for at generere falske positiver eller negativer stærkt reduceret fra tidligere analyser, der omfatter kun én markør pr træk. Denne robuste og enkle analyse kan afsløre disse centrale myg træk omkostningseffektivt og på en brøkdel af den tid af eksisterende analyser.

Introduction

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii og Malariamyg er de store vektorer der er ansvarlige for malaria transmission i Afrika 1. Disse tre arter er morfologisk skelnes 2 og kan kun skelnes ved molekylære assays 3-9. Derudover er der mange downstream assays rutinemæssigt udført for at hjælpe epidemiologiske og populationsgenetik studier. Disse omfatter (1) en genotypebestemmelsesassay for speciering øer 10-12, (2) en genotypebestemmelsesassay anerkendelse af ikke-synonyme SNP'er i 1014 th aminosyre kodonposition para gen (knock-down modstand eller KDR, SNP) 13 -18 (3) påvisning af parasitter PCR 19-23, og (4) screening for host-specifikke DNA i myg midguts 24,25.

Vi udviklede en multi-detektion assay (MDA), der kombinerer alle disse assays i en enkelt multiplex reaktion med målet om etalyzing epidemiologisk vigtige kendetegn ved malaria vektorer i Afrika. MDA assay indeholder flere markører til påvisning af (1) arter (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii eller andre (ingen af de tre)), (2) insekticidresistens repræsenteret i KDR SNP'er (både L1014F og L1014S) (3) tilstedeværelsen af to store malariaparasitter, Plasmodium falciparum og P. vivax, og (4) blod kilde fra en aviær og seks pattedyrværter.

Traditionelt blev disse assays udført i separate polymerase kædereaktioner. Når alle disse assays er udført under anvendelse af en konventionel PCR-platform, kræver det ledende 8-10 PCR-reaktionsbetingelser assays og ledsagende gelelektroforesesystemer trin. Hver enkelt PCR-reaktion fra forberedelse til dokumentere resultater tager 4-5 timer, mens MDA metoden præsenteres her tager omkring 5 timer i helhed. Det svarer til en 90% besparelse i lønomkostningerne alene. MDA præsenteres her koster $ 5per prøve at genotypebestemme alle 33 SNPs. Dette er betydeligt billigere end de enkelte agarose gel-baserede assays, som koster omkring $ 1,50 per prøve. Analyser påvisning alle de egenskaber, der er omfattet af MDA ville kræve et minimum af 8-10 separate agarose gel-baserede assays til en pris på $ 12-15 per prøve. Desuden MDA reducerer chancen for at frembringe en falsk positiv eller negativ ved at udnytte mindst tre markører for hver parasit eller vært kilde detektion.

Platformen vi udnyttet er ikke begrænset til malaria vektorer, men kan anvendes i en lang række anvendelser, såsom medicin, veterinærmedicin og grundlæggende biologi 26-28. Dybdegående associationsstudier eller populationsgenetik undersøgelser, hvor en stor (i rækkefølge efter 100'erne) antal prøver kræver omkostningseffektive assays screening for flere markører samtidig. De fleste undersøgelser, der anvender to eller flere separate PCR-assays kunne gennemføre MDA for hurtigere resultater til en lavere pris. </p>

Protocol

1. PCR-amplifikation Bland alle PCR-primere (se supplerende tabel S1) i en 1,5 ml mikrorør. Hver SNP har to primere (fremad og tilbage). Sørg for, at bestanden koncentrationen af ​​hver PCR-primer holdes på 100 um. Gør nok primer mix til 500-1.000 reaktioner for at mindske pipetteringsfejl og tid på bænken (se supplerende tabel S2). Hvis det ønskes, forberede portioner til 100-200 reaktioner pr rør og opbevares ved -20 ° C. Forbered PCR cocktail som beskrevet i producentens protokol (ta…

Representative Results

Arter identifikation: Følgende 5 SNP'er sammen identificerer tre arter (A. arabiensis, A. coluzzii og A. gambiae) (tabel 4). Hvis en prøve ikke er en af de tre arter, de tre SNP'er (01073-213, 04679-157 og 10.313 -052) undlader at forstærke. KDR genotype for udlede insekticidresistens: Den 1014 th kodon i para spændingsstyret natriumkanal sva…

Discussion

MDA er sammensat af fem store trin: PCR-amplifikation, rejer alkalisk phosphatase (SAP) reaktion, SNP udvidelse, udvidelse produkt condition, og matrix-assisteret laser desorption / ionisering – tid søgning (MALDI-TOF) massespektrometri 33-37. Det første PCR-amplifikation skridt forstærker DNA flankerer hver SNP så nok template DNA vil være tilgængelig på SNP udvidelse trin. SAP reaktion neutraliserer ubrugte dNTP'er, der kan interferere med den følgende SNP udvidelse trin. SNP udvidelse indebære…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Drs. Anthony Cornel og Laura Norris på UC Davis og Dr. Katharina Kreppel ved University of Glasgow for at give myg prøver fra Tanzania. Vi takker Ms Smita Das og Dr. Douglas Norris fra Johns Hopkins School of Public Health til deling myg prøver fra Zambia. Vi takker også Mr. Lee V. Millon på Veterinary Genetics Laboratory til uddannelse på assay design. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health indrømme R01AI 078.183 og R21AI062929.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, d. e. l. l. a., A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  31. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  32. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
  33. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  34. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
  35. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  36. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  37. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  39. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  40. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  41. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  42. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

Tags

Multi-detection AssayAnopheles GambiaeMalariaMosquitoesSpecies IdentificationInsecticide ResistancePlasmodium DetectionHost PreferencePCRELISAMultiplex Genotyping
check_url/pt/52385?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image