Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.
De Anopheles gambiae soorten complex omvat de grootste malaria overbrengen van muggen in Afrika. Omdat deze soorten zijn van dergelijke medische belang, zijn verschillende karaktertrekken typisch gekenmerkt met behulp van moleculaire tests om te helpen bij epidemiologische studies. Deze eigenschappen zijn onder andere species identificatie, resistentie tegen insecticiden, parasitaire infectie-status, en gastheer voorkeur. Aangezien populaties van Anopheles gambiae complex morfologisch niet te onderscheiden, wordt een polymerase kettingreactie (PCR) traditioneel gebruikt om soorten te identificeren. Als de soort bekend is, worden meerdere downstream assays routinematig uitgevoerd om verdere kenmerken helderen. Zo mutaties bekend als KDR in een para-gen verlenen resistentie tegen DDT en pyrethroïde insecticiden. Daarnaast enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) of Plasmodium parasiet DNA detectie PCR assays worden gebruikt om parasieten in muggen weefsels te detecteren. Tot slot, een gecombinen PCR en restrictie-enzym digesties worden gebruikt om gastheer voorkeur (bijvoorbeeld humane versus dierlijke bloed) door screening van de mug bloedmeel voor host-specifieke DNA helderen. We hebben een multi-detectietest (MDA) dat alle voornoemde assays tegelijk combineren in één multiplex reactie genotypering 33SNPs 96 of 384 monsters ontwikkeld. Omdat de MDA bevat meerdere markers voor soorten, Plasmodium detectie, en gastheer bloed identificatie, wordt de kans op het genereren van valse positieven of negatieven sterk verminderd uit eerdere testen die slechts één marker per kenmerk bevatten. Deze robuuste en eenvoudige test kan deze belangrijke mug karaktertrekken kosten-effectief en in een fractie van de tijd van de bestaande tests detecteren.
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii pt Anopheles gambiae zijn de belangrijkste vectoren die verantwoordelijk is voor de overdracht van malaria in Afrika 1. Deze drie soorten zijn morfologisch onderscheiden 2 en kan slechts worden verkregen door moleculaire assays 3-9. Daarnaast zijn er vele stroomafwaarts assays routinematig uitgevoerd epidemiologische en populatiegenetica studies steun. Deze omvatten (1) een genotyperingstest voor speciatie eilanden 10-12, (2) een genotyperingstest erkenning van niet-synoniem SNPs in de 1014 ste aminozuur codon positie para-gen (de weerstand knock-down of KDR, SNP) 13 -18, (3) parasiet detectie PCR 19-23, en (4) het screenen op gastheer-specifieke DNA in muggen midguts 24,25.
We ontwikkelden een multi-detectietest (MDA) dat al deze assays in één multiplex reactie met het doel van een gecombineerdalyzing vanuit epidemiologisch oogpunt belangrijke kenmerken van malaria vectoren in Afrika. De MDA assay bevat meerdere merkers voor het detecteren (1) species (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii of andere (geen van de drie)), (2) insecticide resistentie vertegenwoordigd KDR SNPs (zowel L1014F en L1014S) (3) de aanwezigheid van twee belangrijke malaria parasieten Plasmodium falciparum pt P. vivax, en (4) het bloed bron van de ene aviaire en zes zoogdiergastheren.
Traditioneel werden deze testen uitgevoerd in afzonderlijke polymerase kettingreacties. Wanneer deze testen worden uitgevoerd met een conventionele PCR platform, vereist het uitvoeren 8-10 PCR reactie assays en bijbehorende gelelektroforese stappen. Elke individuele PCR-reactie van voorbereiding tot het documenteren van de resultaten neemt 4-5 uur, terwijl de MDA hier gepresenteerde methode duurt ongeveer 5 uur in totaliteit. Dit komt overeen met een 90% besparing op arbeidskosten alleen. De MDA gepresenteerde hier kost $ 5per monster om alle 33 SNPs genotype. Dit is aanzienlijk goedkoper dan de single agarose gel gebaseerde testen die ongeveer $ 1,50 per monster kost. Assays detecteren alle kenmerken die onder de MDA zou minimaal 8-10 afzonderlijke agarose gel gebaseerde assays vereisen ten koste van $ 12-15 per monster. Bovendien, de MDA vermindert de kans op het genereren van een vals positief of negatief door gebruik ten minste drie markeringen per parasiet of hostbron detectie.
Het platform we gebruik is niet beperkt tot malariavectoren maar kunnen worden gebruikt in uiteenlopende toepassingen zoals geneeskunde, diergeneeskunde en de biologie 26-28. Diepgaande associatiestudies of populatiegenetica studies met een grote (in volgorde van 100s) aantal monsters vereisen kosteneffectieve screening assays voor meerdere markers simultaan. De meeste studies die twee of meer afzonderlijke PCR assays kunnen de MDA inrichting voor snellere resultaten tegen lagere kosten. </p>
De MDA bestaat uit vijf belangrijke stappen: PCR-amplificatie, garnaal alkalisch fosfatase (SAP) reactie, SNP uitbreiding, uitbreiding productconditionering en matrix-assisted laser desorptie / ionisatie – time of flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie 33-37. De eerste PCR-amplificatie stap versterkt DNA flankerende elke SNP zodat er voldoende template DNA beschikbaar zullen zijn bij de SNP extensie stap. De SAP reactie neutraliseert ongebruikte dNTPs die kunnen interfereren met de volgende SNP extensie stap. …
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Drs. Anthony Cornel en Laura Norris aan UC Davis en Dr. Katharina Kreppel aan de Universiteit van Glasgow voor het verstrekken van mosquito exemplaren uit Tanzania. Wij danken mevrouw Smita Das en Dr. Douglas Norris van de Johns Hopkins School of Public Health voor het delen van mosquito monsters uit Zambia. We danken ook de heer Lee V. Millon bij het Veterinary Genetics Laboratory voor het trainen op assay ontwerp. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health verlenen R01AI 078.183 en R21AI062929.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |